项目集锦 | 易基因m6A甲基化（MeRIP-seq）研究成果

m6A是RNA上最丰富的一种修饰，平均每条转录本有1~3个m6A修饰。m6A甲基化通过基因转录后调控，参与细胞分化、胚胎发育、X染色体失活、环境应激和各种疾病的发生发展。

01 猕猴和小鼠模型麻醉影响精细运动能力损伤：MeRIP-seq + RIP + scRNA-seq

标题：Sevoflurane impairs m6A-mediated mRNA translation

and leads to fine motor and cognitive deficits七氟烷麻醉破坏m6A介导的mRNA翻译并导致精细运动和认知障碍

时间：2021

期刊：Cell Biology and Toxicology

影响因子：IF 6.691

技术平台：m6A-seq（MeRIP-seq）、RIP实验(RNA结合蛋白免疫沉淀) 、scRNA-seq

研究摘要：

本研究探索了全麻药物对婴幼儿精细运动能力损伤的机制，并首次关注了m6A甲基化在七氟烷麻醉影响精细运动损伤中的作用和机制。

以前的研究发现全麻药物引起的神经发育毒性机制在非人灵长类和啮齿类动物模型之间尚存在一定的差异，比如临床上观察到多次全麻和手术引起婴幼儿患者远期语言和社交能力的降低和非人灵长类动物模型观察到麻醉后多种社交行为能力的损害，但是多次的麻醉的幼鼠却很难观察到社交能力的损害。研究人员认为在全麻药物引起认知损伤的非人灵长类模型和啮齿类模型中，肯定有同向变化的基因，也肯定有相反变化的基因，应该在临床上找寻出引起全麻药物神经发育毒性的关键科学问题，然后使用非人灵长类动物猕猴去探索全麻药物引起神经发育毒性的机制线索，之后找到猕猴和小鼠具有相同变化的靶基因，使用小鼠模型来进行验证。

基于这个理念，研究人员聚焦到了使用非人灵长类动物和啮齿类动物来研究全麻药物与术后远期精细运动损伤的机制。m6A修饰是在RNA甲基化修饰中最丰富的一种，YTHDF1是m6A甲基化的识别蛋白之一。最近的研究发现其可以参与神经认知的形成和发展。在随后的机制研究中，研究发现七氟烷麻醉后的幼年灵长类和啮齿类动物的大脑中m6A结合蛋白YTHDF1表达显著下调。单细胞转录组测序（scRNA-seq）发现sp8阳性的神经元中YTHDF1的表达下降在中间神经元中最为明显，而这部分神经元，后续会发育成VIP中间神经元。YTHDF1的功能主要是识别RNA上的甲基化位点。通过RIP实验(RNA结合蛋白免疫沉淀)和m6A-seq测序分析发现m6A被高度富集在突触素(Synaptophysin)的mRNA上，同时Synaptophysin的mRNA上有YTHDF1的结合位点。早先的研究发现Synaptophysin和全麻药物的神经发育毒性紧密相关。过表达YTHDF1可以回救七氟烷引起的幼年小鼠精细运动能力和认知功能障碍以及Synaptophysin的变化。研究认为YTHDF1是以m6A甲基化依赖性方式调控其下游靶基因Synaptophysin的表达，继而损伤小鼠的精细运动能力和认知功能。本研究探索了全麻药物对婴幼儿精细运动能力损伤的机制，有望为预防或治疗全麻药的神经发育毒性提供新的思路。

图1：研究摘要 图2：scRNA-seq揭示七氟烷降低了中间神经元中YTHDF1的表达 图3：MeRIP-seq揭示YTHDF1以m6A依赖的方式调节突触素

02 猪胚胎期骨骼肌发育：MeRIP-seq + RNA-seq

标题：Longitudinal

epitranscriptome profiling reveals the crucial role of N6-methyladenosine

methylation in porcine prenatal skeletal muscle development纵向转录组分析揭示了m6A甲基化修饰在猪胚胎期骨骼肌发育中的重要作用

时间：2020

期刊：Journalof Genetics and Genomics

影响因子：IF5.065

技术平台：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、IGF2BP1 RIP-seq

摘要：m6A是最丰富的一类mRNA修饰，可以促进骨骼肌的发育。然而m6A甲基化在胚胎期骨骼肌生成中的状态和功能仍不清楚。研究人员首先证明METTL14（一种m6A甲基转移酶）沉默可抑制成肌细胞的分化，促进C2C12 成肌细胞增殖。采用m6A-seq（MeRIP-seq）测序方法，对猪骨骼肌发育六个胚胎期的纵向转录组和表观转录组图谱进行分析，结果显示：胚胎期骨骼肌发育六个不同阶段的m6A修饰呈现高度的动态变化，且大多数受影响的基因在与骨骼肌发育相关的通路中富集。IGF2BP1

RIP-seq证实了胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)靶向与骨骼肌发育相关通路的76个基因，包括关键肌肉发育标记基因MYH2和MyoG。此外 siRNA介导的IGF2BP1沉默可抑制成肌细胞分化，促进其增殖，类似于METTL14 沉默所观察到的表观遗传变化。本研究不仅阐明了肌肉发育中m6A甲基化的动力学，且确定了参与猪胚胎期骨骼肌发育基因表达的关键基因。

背景

m6A是最丰富的一类mRNA修饰，可以促进骨骼肌的发育。然而m6A甲基化在胚胎期骨骼肌生成中的状态和功能仍不清楚。

方法

研究人员首先证明METTL14（一种m6A甲基转移酶）沉默可抑制成肌细胞的分化，促进C2C12 成肌细胞增殖。采用m6A-seq（MeRIP-seq）测序方法，对猪骨骼肌发育六个胚胎期的纵向转录组和表观转录组图谱进行分析。

实验方法和流程设计

关键图形

图1：猪骨骼肌发育六个胚胎期的纵向转录组和表观转录组图谱 图2：骨骼肌发育六个胚胎期m6A修饰动态表征 图3：m6A基因特征显示基因表达与表型之间存在显著相关性

03 斑马鱼和小鼠模型脊髓再生：MeRIP-seq + RNA-seq

标题：Epitranscriptomic

m6A regulation following spinal cord injury脊髓损伤后的表观转录组 m6A 调节

时间：2021

期刊：JNeurosci Res

影响因子：IF 4.164

技术平台：m6A-seq（MeRIP-seq）、qRT-PCR、RNA-seq

摘要：

RNA甲基化参与多种生理和病理过程。然而，RNA甲基化在脊髓再生中的作用尚未报道。在这项研究中，研究人员发现斑马鱼脊髓损伤（SCI）后m6A（N6-甲基腺苷）RNA甲基化图谱发生改变，与m6A甲基化酶METTL3的转录水平改变一致。且许多与神经再生相关的差异m6A标记基因被低甲基化，但它们的转录水平在SCI中上调。此外，研究人员发现METTL3可能对脊髓再生很重要。另外，研究结果还显示了小鼠SCI模型中METTL3变化的保守特征，即星形胶质细胞和神经干细胞中METTL3的表达水平均增加。总之，结果表明，脊髓损伤后m6A RNA甲基化是动态和保守的，可能有助于脊髓再生。

图1：斑马鱼仔鱼RNA元素中m6A peak的motif和分布 图2：差异m6A标记转录本的KEGG和GO富集分析 图3：转录水平改变的差异m6A标记转录本的KEGG和GO富集分析

04人结肠癌细胞的mRNA m6A修饰及表达：MeRIP-seq + RNA-seq

标题：Effect of Humantenine on mRNA m6A Modification and

Expression in Human Colon Cancer Cell Line HCT116 （Humantenine对人结肠癌细胞HCT116的 mRNA m6A修饰及表达的影响）

时间：2022

期刊：Genes(Basel)

影响因子：IF 4.096

技术平台：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq

摘要：

胡蔓藤碱乙（Humantenine）是一种从药用草药钩吻（学名:Gelsemium

elegans(Gardner & Chapm.) Benth.）中分离出来的生物碱。据报道会引起肠道刺激，但潜在的毒理学机制仍不清楚。本研究旨在研究经Humantenine处理的人结肠癌细胞系HCT116中的 RNA m6A 修饰和不同的 mRNA 转录组图谱。作者通过高通量的MeRIP-seq和对应的mRNA-seq分析，揭示了异常的RNA m6A修饰和mRNA表达在Humantenine诱导的肠细胞毒性中的作用。结果发现HCT116细胞经Humantenine处理后，差异mRNA m6A修饰和差异mRNA表达中有1401个重叠基因。KEGG通路和GO富集分析结果表明，细胞骨架(actin cytoskeleton)、紧密连接(tight

junctions)、粘着连接(adherens junctions)富集，共有11个RNA m6A甲基化调控因子出现差异表达，Humantenine组中靶基因的m6A甲基化发生紊乱。综上所述，本研究提示Humantenine诱导的HCT116 细胞损伤与mRNA m6A 调控因子异常表达及靶基因m6A甲基化水平紊乱相关。

图1：Humantenine诱导与紧密连接、粘附连接和细胞骨架调控相关基因的异常m6A甲基化，破坏mRNA 翻译、储存和衰变 图2：Humantenine组和对照组的 m6A 修饰模式 图3：1401个差异mRNA m6A修饰和差异mRNA表达重叠基因的KEGG通路分析(左)和GO富集分析(右)

05 小猕猴模型麻醉后的m6A甲基化变化：MeRIP-seq + RNA-seq

标题：Epitranscriptomic Analysis of N6-methyladenosine

in Infant Rhesus Macaques after Multiple Sevoflurane Anesthesia多次七氟烷麻醉后小猕猴的m6A表观转录组学分析

时间：2022

期刊：Neuroscience

影响因子：IF 3.59

技术平台：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq

研究摘要：

迄今为止的临床研究表明，接触麻醉剂可能与神经发育缺陷有关。七氟烷是儿科患者最常用的全身麻醉药。动物研究表明，出生后多次接触七氟烷会导致神经病理性脑改变和长期认知缺陷。然而其潜在机制仍不清楚。在这项研究中，研究人员利用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）绘制了小猕猴前额叶皮质的全基因组RNA N6甲基腺苷（m6A）图谱。七氟烷组猕猴的m6A peak值比对照组猕猴高（p≤0.05)。七氟烷处理后，YTHDF1蛋白和YTHDF3蛋白的mRNA表达水平降低，表明七氟烷麻醉动态调节RNA m6A甲基化。GO富集分析表明，七氟烷暴露后，m6A位点甲基化增加的基因在一些与神经发育相关的生理过程中富集，主要集中在突触可塑性（Synaptic plasticity）上。分析发现，雌性猕猴有18个高甲基化基因，雄性猕猴有35个高甲基化基因，且在与突触结构调节相关的一些生理过程中富集。由于猕猴的基因上与人类十分接近，本研究发现有助于在转录水平上研究七氟烷相关神经发育缺陷的机制，并为新生儿麻醉暴露的神经毒性的潜在临床预防和干预提供新的见解。

图1：研究摘要 图2：小猕猴m6A甲基化的一般特征 图3：雄性猕猴经多次七氟烷麻醉后的m6A甲基化和DEGs变化 图4：雌性猕猴经多次七氟烷麻醉后的m6A甲基化和DEGs变化