Clone Manager：RT-PCR/qPCR引物设计

NCBI下载所需基因的转录本序列（NM或NR开头）如GADPH基因，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000012.12?report=genbank&from=6534517&to=6538375，选择GenBank格式。点击Create File下载

Fig1.PNG 下载后拖入Clone Manager打开，显示有GADPH基因这个转录本详细的外显子（中间红色箭头）和CDS注释信息（最下红色箭头）以及限制性酶切位点（Hind III等）。 Fig2.PNG 点击左下角Features，显示详细注释：GAPDH各个外显子以及CDS区起始位点。 Fig3.PNG 选择菜单栏Primer，RT-PCR design wizard，下一步，输入引物长度，点击下一步。因为RT-PCR引物会跨内含子，所以上下游引物需要匹配在两个相邻的外显子上。对着左侧的注释信息选择上游引物的位置， Fig4.PNG 接着下游引物位置 Fig5.PNG

点击完成后，显示所有合格的引物对，评分由高到低。

Fig6.png 选中某一对引物，点击Enter to primer list，两次OK后，即可在Primer，Primer List，Active/loaded看到引物序列，注意：[S1]开头为上一步中选中的那对引物序列，并没有导入primer list，所以不能打开。 Fig7.PNG

选中某一条序列直接双击打开，看到该序列的详细信息。

Fig8.png

点击Export primer sequence就可以导出该序列到剪切板了。
为什么要导出呢，因为关闭Clone Manager后，Primer list中，Active/Loaded文件夹就会清空。