单细胞ChIP-seq方法的比较
写在前面的废话
这篇文章来自于一个舔狗的悲哀，谨以此文告诉大家莫当舔狗……
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以上聊天记录，就是整个故事背景。当时我的内心历程：
- 我看过类似的文章欸，赶紧发出来展现一下我的阅读量，说不定可以被夸
- 怎么回事？怎么和我想得不一样，没有被夸就算了，咋还安排了一个journal？
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好了，废话这么多，进入正题吧
太长不看系列
- coBATCH方法大体上与CUT&Tag使用的方法保持一致，但是略有不同
- 都具有信号高，背景噪音低的优点
废话超多系列
ChIP-seq方法可以为我们揭示细胞的表观组信息，但是这个方法有一些缺点，比如信号低，背景噪音高，细胞所需的起始量较高等……为了解决这些问题，单细胞ChIP-seq方法应运而生。接下来，我将比较最近的两个单细胞ChIP-seq方法。
CUT&Tag方法
这篇文章于今年4月份由Henikoff实验室发表，以下简称为CUT&Tag方法
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实验操作
下图是该方法的具体工作流程：
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- 第一步先对细胞进行透化
- 透化后的细胞使用特异性抗体结合（此抗体可以是任何我们所需要的表观修饰的抗体）
- 加入二抗，此处加入二抗的目的是为了增加后续proteinA-Tn5结合的位点
- 加入proteinA-Tn5融合蛋白。proteinA 提供了特异性结合抗体的能力，而Tn5由于其自身的cut&paste能力，可以对目标序列片段化并加上adapter
- 加入Me2+离子，激活反应
- 对于加上adapter的序列进行PCR扩增并上机测序
方法验证
接下来就是一系列的常规操作了，首先讲一下这个方法如何的好，之前的方法如何的不好，再与之前的方法相比一下，该方法的优点在哪里……
如果时间充足，可以详细看看此处文章是如何优缺点的，如果时间不足，建议直接跳到CoBATCH方法部分
以下讲解都是图在上，具体内容在下，谨慎食用
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- 比较传统ChIP-seq不同测序深度时的信噪比，发现50M reads有更高的信噪比，背景噪音较低。
- 比较相同测序深度的CUT&Tag方法，ChIP-seq方法以及CUT&RUN方法（另一种ChIP方法，依赖于MNase-proteinA融合蛋白，该方法需要人工加接头）。明显能看到CUT&Tag方法和CUT&RUN方法有更高的信噪比
- 比较CUT&Tag方法对于不同组蛋白修饰的测序结果，发现不仅是K27me3，K4me1和K4me2也具有很高的信噪比
- 文章使用一个非特异性的抗体作为阴性对照，发现信号大都很弥散，符合预期
- 此外，作者还使用了ATAC-seq技术分析染色质开放区域，发现K4me2与ATAC-seq信号区域有很高的重合率，并在后续分析中绘制Metaplot以及heatmap进一步验证结果(此处未放图)。最终结果表明H3K4me2对于染色质开放区域的捕获具有很高的灵敏性。
- 除了组蛋白修饰，文章还对RNA PolⅡ进行了分析，得到了相似的结果
此处使用的是K562细胞，为了验证该方法对于细胞类型不具有特异性，对H1 ES 细胞也进行过了上述分析，并得到了相似的结果
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除了对组蛋白修饰以及RNA聚合酶Ⅱ的分析，作者还对转录因子的效力做了进一步验证。
- NPAT是一个组蛋白基因复制依赖的转录共激活因子，结合在chr1和chr6上大约80个位点
- 作者对结合位点进行分析后发现，有一部分信号落在了基因组的开放区域。这一部分信号，作者认为很有可能是由于proteinA-Tn5非特异性结合所导致。
- 不过作者通过分析不同信号的测序深度，可以有效地将转录因子结合位点信号与ATAC site位点信号分离。
- 由于NPAT的结合位点较少，作者进一步分析了CTCF protein的结合位点信号，并得到了相似的结果
此处有一个比较有意思的地方，从正常的角度来看，上述所说的proteinA-Tn5的非特异性结合应该属于一个缺点。但是，作者却反其道而行之，认为该方法在检测转录因子结合位点信号的同时，还可以检测染色体开放区域的信号。所以说，写作技巧和思维真的很重要啊，小伙伴们
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说了这么多，那究竟如何做到单细胞程度呢？如上图所示该方法将细胞分选到一个板子里，保证给板子里的每一个孔都只有一个细胞。这样每个小孔里都加入携带有不同index的proteinA-Tn5，这样就保证了我们后续可以将不同细胞来源的DNA片段分离。
该方法需要借助单细胞ATAC-seq的分选装置，目前已在SMARTer system中测试过，作者认为10X的装置也可以应用于该方法。作者将单细胞的信号累加后与bulk信号相比，发现信号分布程度基本相似。
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接下来作者分析了该方法究竟能不能区分细胞的类型。首先使用Fraction of reads绘制小提琴图，我们可以清楚的看到不同类型的细胞，其分布显著不同。此外，作者还选取了几个基因位点，发现利用一些特定基因位点的信号分布也可以区分细胞类型。
优缺点总结
| 优点 | 缺点 |
|---|---|
| 耗时短（10h） | 需要特殊装置进行细胞分选 |
| 背景噪音低 | |
| 信号水平高 | |
| fraction of reads in peak(FRiP)高 | |
| 可以在细胞内原位反应 | |
| 检测转录因子信号的同时可以检测染色质开放区域 | proteinA-Tn5存在少量非特异性的结合 |
FRiP可以简单的理解为特异性
CoBATCH方法
这篇文章于今年8月份由何爱彬实验室发表，以下简称为CUT&Tag方法。该方法的大致流程与CUT&Tag方法相似，只是在加标签的步骤略有不同
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该方法对细胞进行了两次分选，第一次保证板子里的每个小孔只含有200-250个细胞，此时加入proteinA-Tn5，携带有T5/T7标签。在反应结束后将细胞再次分布，保证板子里的每个小孔只含有20-25个细胞。此时加入含有i5/i7的标签。
最终，我们得到的每个细胞DNA，都含有两个不同的index，保证细胞有不同的index组合（此处小声逼逼，作者此处分析发现大概有7%的细胞可能有相同的index组合，并认为7%很低，我个人觉得这个比例还是蛮高的）
接下来就是和CUT&Tag文章相同的操作了，方法优劣的比较以及该方法的具体应用。因为不做单细胞，所以对于其应用中的具体操作就不在这里介绍了。
方法比较
对上述两种方法做一个简单的比较，个人见解，欢迎大家指正：
| CUT&Tag | CoBATCH |
|---|---|
| 一抗孵育一次，二孵育一次 | 只用抗体孵育了一次 |
| 分选一次 | 分选两次 |
| 每个小孔中只有一个细胞 | 第一次分选：小孔中有200-250个细胞；第二次分选：20-25个细胞 |
| 没有index重合 | index重合率为7% |
| 需要借助特殊装置分选细胞 | 文章未声明，也许不需要使得实验操作更加平民化 |
总之，要想更准确，推荐第一种方法；要想操作简便，推荐第二种方法
一点题外话
大家或多或少都会使用R进行数据分析，而其中的bioconductor又是我们躲不掉的阻碍。因此想在这里问问大家，是否愿意从头开始学bioconductor，而不仅仅是简单的对代码复制粘贴。比如，GRanges对象，biomaRt的使用等……
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