序列组装

序列组装是测序的下游工序，但在日益多样化的基因组学研究中，这不是必须的。尽管如此，进行序列组装无疑能够帮助我们更精确认识物种的遗传信息，唯有高质量组装的完成，方能做进一步、更全面和深层次的探索。

在《一代测序》中，由于组装对测序具有指导意义，已将两种主要的组装策略进行了介绍。鸟枪法（shotgum method）和克隆重叠群法（clone contig method）分别是以“先测后定”与“先定后测”的思想开展的。结合图谱中的标记物，便能实现较准确的拼接。然而，无论是哪种方法，进行单次的克隆文库测序，都无法将同一染色体所有片段无缝衔接，而存在大大小小的“序列间隙”与“物理间隙”。“序列间隙”是那些测序时遗漏的序列，这些序列仍保留在尚未挑选到的克隆中。“物理间隙”则是构建文库时被丢失的DNA序列，它们可能从已知的克隆群体中永久性地消失了。“物理间隙”产生的原因可能是：（1）由于特殊的碱基组成，如染色体着丝粒区的高度重复序列缺少合适的酶切位点，难以获得大分子DNA克隆（克隆重叠群法）；（2）在克隆载体中，高度重复序列很不稳定，在扩增中丢失了；（3）某些基因的表达产物对宿主菌具有毒性，因此转染到宿主上容易将其杀死；（4）序列装载在载体上若形成反向重复，宿主可能无法对装载有外源DNA的载体开展复制。

对于“序列间隙”可以通过分子杂交的方法填补。即设计已知间隙两端的寡核苷酸探针，将某间隙其中之一端的寡核苷酸加入所有克隆，筛选阳性克隆，再在阳性克隆中加入该间隙另一端的探针，若又存在阳性，则对两次阳性的克隆进行测序，便填补了这一间隙。

为了封闭“物理间隙”，可以用一种不同的载体制备第二个克隆文库，这回选择不同的载体类型，能将原先对上一种载体有害或导致不稳定原因引起的部分“物理间隙”填补。仍然是用分子杂交方法筛选阳性克隆。实际上，受技术限制，一代测序时代想完全填补“物理间隙”极其困难。

此前，留的一个问题：基因组作图并不是测序组装之必须，那么序列组装对图谱的依赖程度如何呢？

在一代测序与二代测序时代，由于序列读长短，很明显，串连重复序列对组装具有很强的迷惑性，使得组装这些片段极为困难，时常导致错误组装，因此图谱便显得极为重要，利用分子标记进行校正，让各片段一一对应起来。但当时也认为任何小于5Mb的小型基因组序列，包括切割成克隆重叠群的大片段，即使在计划开始前不知道基因组的任何信息，也能基于鸟枪法实现组装。

这种局面在“单分子实时测序”技术发明后有所改观。由于是单分子测序，加之实验材料的改进，使其规避了早期二代测序的弊端，序列读长大大增加。例如Pacific BioSciences SMRT RS测序技术的平均序列读长在10kb以上，最长可达40kb。如此一来，只需将重叠区设置长一些，使得串连重复含括在一个读长之内，便能在没有图谱与标记物的情况下实现快速组装。不得不说，如今组装的许多高质量基因组都是未先绘图而直接进行测序的，然后再将拼接好的序列对应于染色体上。

参考文献
[1] T. A. 布朗. 基因组3[M]. 第一版. 北京: 科学出版社, 2009.
[2] 杨金水. 基因组学[M]. 第2版. 北京: 高等教育出版社, 2007.