Knock in

后期要用到KI技术，现在先敲入一个荧光练手

目标

细胞：HEK293细胞

基因：GAPDH基因 改为ActB（原因见下）

选择标记：mNeonGreen（原因见下）

设计流程&实验流程

选定靶标基因
选择Cas9靶标区段
设计Cas9 sgRNA
合成sgRNA载体（含cas9）
设计供体载体
构建供体载体

设想进化

两株细胞GAPDH基因C端分别敲入Linker-3*FLAG-TGA和Linker-mNeon-TGA，用于IP和成像
一株细胞GAPDH基因C端同时敲入Linker-3*FLAG-loxp-mNeon-TGA-loxp，用于成像同时可以Cre切割loxP用于IP
一株细胞GAPDH基因C端敲入Linker-lox71-3*FLAG-Linker-mNeon-TGA-lox2272，方便使用RMCE在高效lox序列间替换所需标签
一株细胞GAPDH基因C端最后一个内含子中敲入lox71-Intron-Exon-Linker-mNeon-TGA-lox2272，减少lox序列对氨基酸的影响，donor使用loxP+lox2272
一株细胞Actin基因C端最后一个内含子中敲入lox71-Intron-Exon-Linker-mNeon-TGA-lox2272。反正都是测试，actin说不定还能看丝状结构何乐不为
一株细胞Actin基因C端最后一个替换为人工内含子，敲入lox71-Intron-Exon-Linker-mNeon-TGA-lox2272。多个sgRNA靶向该内含子，而每个sgRNA都要在相应的donor上把Cas9靶位点沉默掉。构建多个突变质粒过于繁琐，索性改为不含Cas9靶位点的人工内含子。一次质粒构建，多次使用。

供体载体

1. 使用两端各含有800-1000bp同源臂的质粒作为donor。效率低但是方便通用
2. 使用两端各含有500bp同源臂+sgRNA靶位点的质粒作为donor。切割释放donor片段提高编辑效率(但是不方便用一个donor对应多个sgRNA，相当于每个sgRNA都要配套的donor质粒)

涉及到的额外知识点

sgRNA选择

两篇论文使用机器学习得到高效sgRNA设计规律，直接使用预测结果即可。

http://deepcrispr.info/DeepSpCas9variants/
http://www.deephf.com/index/#/Predict

荧光蛋白选择

根据荧光蛋白数据库(https://www.fpbase.org/table/)按亮度筛选单体荧光蛋白

选择mNeonGreen，因为亮度强(92.8)、分子小、手上有。

相对之下常用的EGFP亮度弱(33.5)，还有弱二聚体倾向(weak dimer)。

最亮单体单白表

内含子知识点

本例中ActB内含子分析

ActB内含子

参考

http://what-when-how.com/molecular-biology/splice-sites-molecular-biology/

https://en.wikipedia.org/wiki/RNA_splicing

https://www.fpbase.org/table/

Lambert, TJ (2019) FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277–278. doi: 10.1038/s41592-019-0352-8