今天分享一篇发表在NBT上的一篇叫做“Spatial metatranscriptomics resolves host-bacteria-fungi interactomes”的文章。

Spatial metatranscriptomics resolves host-bacteria-fungi interactomes

微生物之间以及它们与多细胞宿主之间形成复杂的空间调控模式。由于现有分析方法的局限，植物内部的微生物相互作用通常是基于整个组织的微生物测序去探索。这种方法无法在细胞或者空间尺度解析丰度的差异。随着空间转录组和单细胞组学的发展，便有望在空间分辨率去发现植物-微生物互作的关键信息。
在这个paper里，作者提出了空间宏转录组学（图1），利用16S/18S/ITS/poly-d(T)多模式探针，同时对宿主转录组和微生物组进行全面的解析。通过捕获细菌、真菌序列以及宿主mRNA的空间分布，来探索微生物空间分布和宿主基因表达之间的关联。

图1

=======实验设计======

这个paper中选取是拟南芥叶片。

=======实验结果======

1. 细菌侵染和宿主响应的空间检测

作者尝试从拟南芥叶片切片中捕获mRNA分子。通过荧光标记的cDNA合成后，获得了一个荧光足迹，其形态基本与原始拟南芥叶片相匹配（图2a），证明了此方法可以基因空间表达模式。
接下来，作者用16S捕获方法分析了拟南芥叶子，叶子被模式病原体番茄赤霉素假单胞菌侵染，后经过基因标记在整个叶片中进行荧光成像（图2b）。在这个paper中，作者使用了两种探针阵列（P799和P902），用于捕获细菌和古菌。结合poly-d(T)探针捕获宿主mRNA，混合比例如下：50% poly-d(T)，25% P799和25% P902。

在侵染后3天，对感染的叶子进行成像，以记录细菌侵染的荧光空间模式。作者在整个组织切片内成功检测到了宿主和细菌分子，从而证明了组织侵染和RNA杂交的成功。

在侵染的叶片中，共识别出512,779个reads，其中92.4%是来自假单胞菌。假单胞菌分子在侵染部位周围最高，并逐渐向远端区域减少，从而提供了比荧光成像更全面的展现。并且假单胞菌探针信号与荧光信号之间存在较强的正相关（r = 0.21）（图2b），这表明探针在捕获微生物梯度变化方面更灵敏，这一点是荧光信号无法做到的。

图2

2. 同时检测多样化微生物和宿主的空间数据

在证明可以捕获细菌后，作者又接着尝试是否可以加入更多的探针，来检测更多的微生物，比如真菌。因此，借鉴以往的方法，他们又尝试加入针对真菌的ITS探针，并比较单探针模式和多探针模式的性能差异。为了对比，作者设计了三种不同的探针阵列：100% poly-d(T)探针、100% 16S 探针和100% 18S rRNA/ITS探针，以及包含这三种探针阵列：10% poly-d(T)，45% 16S和45%18S rRNA/ITS。

作者选取户外的三片拟南芥叶子，将其分成四个14微米厚的纵向切片，并使用这四种探针类型分析每片叶子的切片。与非特异性的poly-d(T)探针相比，多探针和单探针显著提高了分类的捕获比例。例如：多探针阵列检测出来的细菌和真菌属比例提高了19和31（附图4）。和假设一样，多探针阵列富集的微生物信号低于单一16S和18S的细菌和真菌浓度。

附图4
附图4

从捕获的细菌和真菌来看，多探针阵列基本都可以重现单一16S和ITS捕获的结果，相似性可以高达0.93和0.74（图2c）。Bray-Curtis相似性分析表明，使用16S获得的细菌数据和多探针阵列最相似。ITS获得的真菌数据和多探针阵列最相似（图2d）。

然后作者还探索了不同探针浓度对于结果的影响。作者发现Shannon多样性指数在45%探针浓度下变化趋于不变（附图13，其实我看不出来这个趋势。从图中看，我觉得20%左右基本都不变化了）。

附图13

3.用扩增子测序来验证多模式阵列

为了捕获更多细菌，作者又在多探针阵列中加入了其它的两个16S探针：P479和P1265。然后作者把多探针阵列的结果和纯16S的测序结果进行比较（图2e）。
多探针模式检测到的细菌分类总数是16S的三倍以上，包含V4-V6的71%，V3-V4的65%图2f）。然后作者基于相对丰度的Bray-Curtis距离，比较了这3个方法，发现了相似的趋势（图2g）。

4. 叶片中的微生物热点区域掌控微生物的互作

然后，作者用这个多探针的方法检测了户外的拟南芥叶片中的微生物情况。从微生物分类上来看，不同部分的微生物构成类似，反映了植物生长环境的相似性和他们方法的可重复性（图3a）。如果仅仅考虑相对丰度超过1%的微生物，共29个细菌属和23个真菌属。不同微生物的相对丰度在不同部分、叶片或整个植物上的变化不大。
查看细菌和真菌属的空间分布，表明微生物几乎存在于整个叶面上——在99.9%的采样点都检测到独特的细菌属，平均密度约为277；在97.5%的采样点均能检测到独特的真菌属，平均密度约为261（图3b）。尽管在整个叶面上检测到了细菌和真菌，但它们集中在某些热点区域，而不是均匀分布（图3c），并且一些热点由细菌和真菌共享。不同热点的相对丰度在13个叶片切片中差异很大（图3d）。
一般情况下，微生物的相互作用受到空间位置的限制。所以作者猜测这些共享的热点区域是否控制了界间和界内微生物相互作用的比例。因此，作者挑了top 50最丰富的细菌和真菌，计算他们相互作用网络。网络的平均相关性大约0.35. 共享热点界间相对作用的相关性大约是0.72，细菌-细菌大约为0.72，真菌大约为0.47（图3e）. 从而说明叶片内共享热点的具有很强的相关显著性。

图3 图3

5. 微生物热点和宿主基因表达的关联

接下来，作者探索了共享的热点对于宿主-微生物相互作用的关系。先利用宿主的数据，进行了降维分析。UMAP结果表明宿主的表达可以分为5个cluster（图4a）。和其它单细胞数据结果类似，这些cluster反映了叶片的基本组织结构，其中不同的细胞类型分布相对均匀，维管组织除外（图4b）。cluster 1和2在基因表达模式上比较相似，空间构成也确定了大部分是由叶肉细胞类型组成的斑点（图4c）。作者highlight了几个marker基因。例如：CAB3在簇2中上调。但是，五个cluster并没有那一个和微生物峰度相关度高，没和高热点区域重合。
所以，作者尝试挑余微生物峰度高度关联的基因。要求至少在三个不同的区域和微生物都高度关联，最终获得了645个和细菌，442个和真菌峰度高度关联的基因。GO分析表明很多与植物免疫反应相关，例如GO:0042742—"对细菌的防御反应"和GO:0006979—"对氧化应激的反应"（图4d）。其中，总共有73个（11%）与细菌和/或真菌的防御反应相关。作者从中focus到了3个基因：ACD6、CA1和LURP1。这三个基因都与基础植物免疫有关—ACD6是由多种微生物激活的广谱病害抗性基因，CA1基因产物结合免疫相关激素水杨酸并在病原体入侵期间调节气孔开放，LURP1是对病原体Hyaloperonospora parasitica的抗性所必需的。

图4 图4