【单细胞全图谱】小鼠单细胞衰老图谱

今天分享一个同样来自小鼠单细胞图谱课题组的另外一篇文章，在《Nature》上发表的，题目是“A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse”。文中报道了随衰老变化的详细的分子和细胞类型特异性的细胞图谱。

在这个研究中评估了不同年龄特征的细胞类型特异性表现，如衰老、基因组不稳定性和免疫系统变化，同时，对于不同器官的细胞类型的变化进行评价比较，最终构建了包含丰富的分子生物学信息的转录图谱，即小鼠衰老细胞图谱，它提供了关于衰老最重要的特征是如何体现在广泛的组织和细胞类型中的分子信息，进一步加深了对于衰老的相关过程变化的理解。

A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse

在实验中首先对来自6个年龄组（1个月到30个月）的雄性和雌性C57BL/6JN小鼠进行了单细胞RNA测序(图1a)。实验中制备了小鼠膀胱、骨髓等23个器官的单细胞悬液。采用微流体滴法收集所有6个年龄组的数据，在微孔板中选择3个月、18个月和24个月的时间点的单细胞进行分选。液滴数据使用3′端计数对大量细胞进行分析，而FACS数据允许对更少量的细胞进行更高灵敏度的测量，并允许获取整个转录子长度的序列信息（Extended Data Fig. 1）。对同一只老鼠的多个器官的分析使我们能够获得受年龄、环境和表观遗传影响控制的数据。

基于前面发表的小鼠全组织单细胞图谱注释信息，来对新数据进行半自动化注释(图1b)。从中获得了之前未在群体中发现的许多细胞类型，并提供了大量的特征基因表达谱相关的新信息。然后采用bbknn批处理对齐算法来校正方法相关的批处理效果，批处理校正后，使用无偏见的、基于图象的聚类方法对所有细胞进行聚类分析(图1c-d)，并评估在同一簇中注释相似的细胞的相关性。例如，标注为B细胞或内皮细胞的细胞，无论其来源组织或处理方法如何，都倾向于占据相同的簇(图1e-f)。

图1 Extended Data Fig. 1 | UMAP visualizations of the whole Tabula Muris Senis.

单细胞数据能够解决大量实验中观察到的由于群体中每个细胞的基因表达变化引起的变化，或每个细胞的基因表达保持不变而该类型的细胞数量发生变化，或者两者都有。通过小鼠全组织单细胞图谱和RNA-seq数据分析基因表达变化，在许多情况下基因表达的变化是由于两种细胞的数量变化和每个细胞的基因表达水平的变化引起的。

Cdkn2a及其蛋白产物p16的表达是衰老的重要标志，因此这个paper中以此为例研究了表达Cdkn2a的细胞是如何随年龄变化的。FACS和液滴法分析显示，高龄小鼠中表达Cdkn2a的细胞比例比年轻小鼠高出一倍以上(图2a-b)，p16在其表达的细胞中表达水平增加了两倍(图2c-d)。Cdkn2a在衰老和表达它的细胞中呈现出较高的相关性。 每种组织类型的细胞组成往往随年龄而变化。通过实验发现，随着年龄的增长，膀胱细胞类型的组成出现了明显的变化(图2e)，其膀胱组织间充质间室减少了三倍，尿路上皮间室增加了相似的数量。观察发现膀胱尿路上皮细胞比例随年龄增加与已知年龄相关尿路上皮改变一致。通过差异基因表达分析对组织随年龄的整体变化进行评估，发现基质相关基因下调，而上皮相关基因上调，这与观察的结果相一致。同时，内皮细胞数量下降表明，小鼠膀胱老化可能与较低的器官血管化有关，这与最近的发现以及观察到的血管相关基因Htra1和Fos的下调相一致(图2f)。 年龄相关的肾脏也随着发生变化。系膜细胞和毛细血管内皮细胞都是肾小球的核心细胞，它们的相对含量随着年龄的增长而减少(图2g)，同时Egf和Atp1a1的表达在组织范围内减少表明肾小球滤过率受损。值得注意的是，在毛细血管内皮细胞和系膜细胞中，局部Atp1a1的表达均随年龄增长而增加，差异基因表达分析的结果证明了这一结论。组织中Umod的表达减少表明正常的肾脏功能受损(图2g-h)。 在脾脏，T细胞的比例随着年龄的增长而减少，而浆细胞的相对数量增加，同时B细胞和浆细胞标记基因上调和Cd3d的下调(图2i)。同样，在乳腺中发现T细胞数量下降。年龄相关的T细胞数量减少与感染性疾病和癌症的风险增加有关，实验结果表明，这种减少也可能发生在脾脏和乳腺。此外，编码AP1转录因子的基因(Junb、Jund和Fos)随着年龄的增长而上调，这与观察到的乳腺正常衰老伴随着该基因家族表达的增加相一致。

图2

肝脏的组织结构也随着年龄的增长而变化。通过实验发现与年龄相关的肝细胞相对数量减少，且蛋白的表达也呈下降的趋势。之前的研究表明，巨噬细胞促进细胞衰老，且肝脏中Il1b基因随着年龄的变化而呈现显著的改变。通过肝脏普弗细胞的原位杂交对Clec4f标记和组织成分分析的发现，Clec4f阳性细胞的数量不随着年龄的增长而变化（Extended Data Fig. 6）。肝窦内皮细胞(LSECs)在免疫防御中发挥独特作用，是肝脏中甘露糖受体(MRC1)的主要载体。研究发现普弗细胞Mrc1的表达随年龄增加，而肝脏内皮细胞中Mrc1的总体表达随年龄减少。在衰老肝脏中LSECs的吞噬能力下降，表明在损伤后LSECs增殖，或骨髓来源的LSEC祖细胞被募集至肝脏。这表明随年龄变化的LSECs基因特征的改变与其在免疫反应中的功能密切相关。 

Extended Data Fig. 6 | Cellular changes during ageing in the liver

基因组不稳定性是衰老最广泛的特征之一，全长转录数据可以分析细胞突变随年龄的积累。这个paper中，作者鉴定了所有FACS样本的SNP。基于在75%的细胞中都表达的基因，作者发现所有器官中与年龄相关的突变数量增加，其中舌和膀胱影响最大。通过ERCC验证了突变的数量超过了扩增和测序错误的预期(图3)。尽管由于各种原因，转录组会夸大表观突变率，很难从转录组中推断出全基因组的绝对突变率，但观察到的趋势对于估计突变频率和基因组的稳定性具有非常重要的价值。

图3

衰老也会影响免疫系统。paper中作者对FACS数据中出现的B细胞和T细胞受体的序列进行了计算重建分析。分别组装了6050个B细胞的受体和6000个T细胞的受体(图4a-b)。通过进一步对B细胞和T细胞的变化的发现，24个月大的小鼠的免疫系统几乎不能对新的病原体做出反应。这也与文献报道的老年人较年轻人易感性更高，接种疫苗的益处更低的观点是一致的。

最后，研究小组计算了一个整体多样性评分，以确定哪种细胞类型更容易受年龄变化的影响。发现起源于大脑和肾脏的免疫系统细胞的多样性发生显著变化(图4c)。在大脑骨髓小胶质细胞，大多数年轻(3月)小胶质细胞聚集成簇1和6，而衰老的(18个月和24个月)小胶质细胞聚集成簇10，12和14(图4d)。与簇1和6相比，簇10，12和14富含干扰素反应或监管的基因，这表明在衰老的大脑中，小胶质细胞的这个小的促炎亚群有扩张的趋势。此外，“年轻”和“年老”簇间差异表达基因的列表与之前报道的阿尔茨海默病特异性小胶质细胞特征相似(图4e)。关于肾巨噬细胞，实验中发现两个簇状细胞的组成随年龄发生显著变化。簇10主要由1月和3月大小鼠的细胞组成，而簇13主要由18月、21月、24月和30月大的小鼠的细胞组成(图4f)。基因的差异表达显示簇10富含M2巨噬细胞的基因标记，而簇13类似于M1促炎巨噬细胞的状态。

图4