文献翻译--转录因子对可变剪接调控网络的多层控制

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276517300370

摘要：

协调的可变剪接事件网络在发育和疾病中起着至关重要的作用。然而，对调节这些网络的因素缺乏全面的了解。我们描述了一个高通量系统，用于系统地将反式作用因子与内源性RNA调节事件联系起来。利用这个系统，我们确定了数百个与不同调控层相关的因子，这些调控层积极或消极地控制与细胞命运相关的AS事件。值得注意的是，超过三分之一的调节因子是转录因子。对锌指蛋白Zfp871和BTB/POZ结构域转录因子Nacc1的进一步分析，揭示了它们在控制特异性剪接调节因子表达中的作用，所述转录因子分别调节神经和干细胞AS程序。令人惊讶的是，这些蛋白质似乎也通过结合RNA来调节AS。因此，我们的结果揭示了注释转录因子中剪接调节因子的一个巨大的“缺失缓存”，其中一些转录因子通过直接和间接机制双重调节AS。

前言

选择性剪接是选择前体基因中不同剪接位点的组合，产生结构和功能不同的基因和蛋白质变体的过程。它广泛用于扩展后生动物基因组的功能和调节能力。例如，来自人类多外显子基因的几乎所有转录物都是交替剪接的，并且这些剪接变体的相当大部分以细胞和组织特异性的方式差异表达(潘等人，2008；王等，2008)。As在多种生物过程中具有关键作用，包括细胞命运决定，as的失调与许多疾病有关。一个重要的挑战是理解as事件网络是如何协调调节的，以在不同的细胞环境中赋予其生物学作用。

AS的时空特异性受顺式调控元件和同源反式作用因子的组合控制，它们促进或抑制剪接体的组装。AS还受与其他调控层的协同相互作用控制，包括转录和染色质(Braunschweig等人，2013年)。此外，翻译后和信号通路通过不同的机制影响AS，例如通过改变关键剪接调节因子的功能和/或定位（Heyd和Lynch，2011）。然而，剪接调节器的完整功能以及不同细胞类型的相关机制尚不清楚。这个问题尤其与AS模式相对复杂的细胞类型有关，如胚胎干细胞（ES）和神经细胞。

在AS大规模调查策略的制定方面取得了相当大的进展。基于荧光或荧光素酶的剪接微小基因报告基因已被用于高通量RNA干扰(RNAi)、小分子和cDNA过表达筛选，以发现控制单个AS事件的因子。然而，由于剪接报告子往往不能概括AS调控的重要方面，如与染色质和转录成分的干扰，因此需要采用高通量方法来监测内源性AS变化。这方面的进展包括使用高通量定量PCR (qPCR)方法筛选芽殖酵母突变株，用于剪接调节因子，和自动RT-PCR平台结合毛细管凝胶电泳或测序来监测候选调控因子敲低对凋亡和增殖相关AS事件的影响。这些研究阐明了核心剪接调节因子和辅助剪接调节因子之间有趣而重要的功能关系，以及控制特定as事件的其他因素。

在这项研究中，我们描述了“条形码测序耦合内源性RNA调控的系统并行分析”(SPAR-seq)，一个多路和定量功能基因组学筛选平台，与测序输出相结合，能够全面地将反式作用因子与数十个感兴趣的内源性基因调控事件联系起来。我们使用SPAR-seq来阐明控制保守的内源性AS事件的调节网络，这些事件与胚胎干细胞的多能性、神经分化和体细胞重编程有关。我们的结果揭示了数百个之前未知的剪接调控因子与不同的调控层相关，它们影响ES和神经细胞中这些AS事件的不同子集。令人惊讶的是，在神经细胞中，注释转录和dna结合因子影响AS事件的频率与定义的剪接调控因子相同。对Zfp871和Nacc1的进一步研究表明，这些因子分别直接和间接调控神经网络和es -细胞-分化AS网络。因此，本研究介绍了一种用于阐明内源性RNA调控网络的多功能技术，并强调了其在揭示反式调节因子和相关的多层机制方面的应用，这些调节因子在细胞命运决定中发挥关键作用。

结果

一个高通量系统将反式作用因子与内源性AS事件联系起来

为了系统地发现控制内源性AS网络影响细胞命运的因素，我们使用SPAR-seq询问了1536个小干扰RNA (siRNA)敲低和控制治疗对52个进化保守的(即在人类和小鼠之间)AS事件的影响，这些事件与ES细胞的多能性，神经分化和体细胞重编程有关。(图1A;表S1)。在特异性siRNA敲除后，96孔板上的多重RT-PCR同时扩增了52个优先级AS事件。独特的双指数条形码被添加到逆转录聚合酶链反应扩增子中，以标记每个孔。随后对条形码扩增子进行汇集和高通量测序分析，然后将特异性敲除与AS事件的变化联系起来。

分析的AS事件包括35个盒外显子，包括8个微外显子(3 - 27nt)，来自8个具有更复杂AS模式的基因的15个替代外显子，以及通过基因剪接定位识别的Foxm1中两个之前未注释的3’端剪接位点事件。在小鼠ES (CGR8)和神经母细胞瘤(N2A)细胞中进行筛选，以确定AS事件的阳性和阴性调节因子。被敲除的基因包括654个已知的和假定的剪接/RBP相关因子，包括所有注释的剪接体相关蛋白，以及所有已知的和预测的RNA结合蛋白(rbp)(图1B;表S2)。我们还询问了CGR8或N2A细胞中表达的858个与染色质和转录相关的注释基因，其中161个与剪接和RNA结合相关的注释基因重叠。此外，我们（还发现了）检测了65个与AS调控相关的信号传导和翻译后因子(图1B;表S2)。

转染siRNAs后48小时收集总RNA并进行SPAR-seq。设计了一个分析管道来提取数据，通过计算外显子拼接值（PSI）的百分比来量化AS水平，并使用“严格标准化的平均差（SSDM）”对检测到的AS水平变化（PSI）进行优先排序，以便进一步分析(图1C；图S1B和S1C表S3；STAR方法)。SSMD测量效应大小，同时考虑重复之间的差异。总共有316，863个AS测量值通过两个生物复制筛选进行了分析。SPAR-seq数据还用于监测所有基因的mRNA表达水平，分析剪接变化，以及一组代表性的剪接因子(图1C；表S4；STAR方法)。这些数据表明进行敲除的所有受监测基因的消耗超过60%(图S1D)。使用来自CGR8和N2A细胞的独立样本进行的逆转录聚合酶链反应实验验证了SPAR-seq检测到的几乎所有分析的AS和基因表达事件的变化(图S1E)。此外，筛选检测到的PSI变化的幅度与使用独立逆转录聚合酶链反应(r = 0.77，n = 335)和RNA测序(RNA-seq) (r = 0.89，n = 224)测量的变化密切相关(图S1E和S1F)。

阴性对照(32个 siNTs，非靶向siRNA;32模拟控制;24个未处理样本)一致导致PSI水平几乎没有变化，而阳性对照(32个siMbnl，同时下调Mbnl1和Mbnl2)导致许多es细胞差异AS事件向ESlike模式的显著变化，而没有显著影响神经丰富的AS事件，与我们之前的结果一致(图1D;图S2A) (Han等，2013)。单个敲除Mbnl蛋白和其他先前与多能性和重编程相关的调节因子，包括Rbfox2、Son、Srsf2、Srsf3和U2af1 ，也影响es -细胞分化AS事件(图1D;表S3)。相反，在N2A细胞中敲除神经元特异性剪接调节因子nSR100/Srrm4会影响神经丰富的AS事件，而不会显著影响es -细胞分化的AS事件(图1D)。其他分析进一步证明了筛选数据的特异性和再现性，无论是在重复实验中还是在重复实验之间(图S2B)。总之，在CGR8和N2A细胞中分别敲除220和416个因子，会导致一个或多个内源性AS事件发生显著变化(图1D，柱状图)。

相关AS变化揭示了多层调控途径和复合物

为了研究影响AS的因素之间的功能关系，我们通过CGR8和N2A细胞敲除的所有成对比较来确定52个AS事件的PSI值变化之间的总体相关性。基于两两相关相似程度的结果数据聚类显示了一组因子，这些因子以相似的方式正或负调节AS事件（图2A和2B；表S5；STAR方法）。与先前的结果一致（Papasaikas等人，2015； Tejedor等人，2015），这些组通常会大量富集在不同生物学过程和途径中起作用的因子，并且在许多情况下，它们在复合物中相互作用。作为这种方法的补充，我们通过对复杂成员之间的平均成对相关性进行评分，系统地调查了实验定义的复合物中的因素（来自CORUM； Ruepp等，2010），以协调AS变化（图3A；表S6）。值得注意的是，在我们的筛选（screen）中至少由三个因素代表的316种复合物中，CGR8中的38种（12％）和N2A细胞中的187种（59％）在筛选以上显示出显著的相关性（错误发现率[FDR] <0.05，Mann-Whitney U 测试）。 因此，SPAR-seq数据将蛋白质复合物链接到与细胞命运相关的AS事件特定亚组的控制，从而提供了对反作用因子之间物理和功能相互作用的了解。

CGR8细胞中最大的相关敲除组之一涉及与17S U2小核核糖核蛋白颗粒（snRNP）相关的因子（图2A，簇8），其在剪接体形成期间结合前mRNA分支位点（Wahl等人，2009）。显著的是，相关程度反映了这些成分之间的物理关系（Papasaikas et al。，2015）：七聚体Sm复合体的成员形成一个中央的，高度相关的模块，与其他（即SF3a / b）U2 snRNP成分相邻。相比之下，有助于U2 snRNP募集至前mRNA的辅助因子，例如U2af1和U2af2（Wahl等，2009），以及内含子结合复合物（IBC）成分Aqr和Isy1（De等，2015），与核心U2 snRNP蛋白的相关性较低，并形成一个独特的簇（图3B）。另一个独特的子集群包括Rbm17，Cherp，U2surp和Dhx15。 Rbm17通过与U2 snRNP相互作用并在剪接的第二个催化步骤中识别3’个剪接位点AG（Corsini等，2007; Lallena等，2002）来控制剪接位点的选择，并与U2surp和Dhx15相互作用（Hegele等。 ，2012）。敲除这些因子的相关影响表明，它们可能在调节与细胞命运有关的AS事件的子集中具有密切相关的功能。

有趣的是，U2-snRNP相关因子在胚胎干细胞和重编程细胞中的表达比在分化细胞或组织中的表达更高（图S3A）（Han等人，2013；Hirsch等人，2015），这些因子的敲除使胚胎干细胞分化的子网络随着事件向分化细胞样模式转变（图2A；表S3和S5）。总之，这些结果表明，U2-snRNP相关组分水平的增加可能对维持ES细胞特异性AS模式很重要，而水平的降低则与分化细胞有关。

不同基因调控层在AS控制中的正负作用

在我们的筛选数据中，其他显著相关的敲除簇包括形成参与剪接的额外亚复合物的因子，但也包括与RNA聚合酶II（pol II）转录、染色质修饰、DNA结合/转录因子活性、mRNA监测、转换、转运和翻译相关的复合物和途径，（图2和3A）。这些簇中的许多因素以前都没有与剪接控制联系起来。

其中一个簇包含与外显子连接复合体（EJC）相关的多种因子，EJC通过无义介导的mRNA衰变（NMD）途径控制剪接依赖的mRNA输出和转换（Tange等人，2004）。敲除“核心”EJC成分（即Eif4a3、Magoh、Rbm8a和Casc3）比敲除“非核心”EJC因子（即Ddx39b、Alyref、Srrm1和Rnps1）对AS模式产生更高的相关性（图3C）。虽然外周EJC因子Srrm1和Rnps1（两个因子为EJC非核心成分的因子）已报道在剪接调控中起作用，但目前的数据与核心EJC相关成分也调控AS的新证据一致。此外，我们的结果将这些因素与细胞命运相关的AS事件子集的控制联系了起来。

我们的数据还揭示了AS的反相关（即拮抗）效应（图2）。例如，与转录/DNA结合活性相关的因子（例如Nfyb、Tbx1和Tfdp1）的敲除（图2A，簇10）导致Foxm1作为与剪接相关因子子集（例如Snrnp200、Bcas2、Rbfox2和Mbnl蛋白）的敲除负相关的变化（图2A，簇3）（p<0.01，单侧）二项检验）。在Arg/Ser重复序列（RS）结构域蛋白和其他因子之间也观察到拮抗（和正）效应（图2A，例如簇2和簇5）。例如，敲除先前未鉴定的剪接调节因子精氨酸和富含谷氨酸的1（Arglu1）蛋白和Srsf2对筛选中监测的6（5个？）个（这6个AS事件，为E和s3B图中的测试的6个因子的AS事件的变化）As事件具有相反的影响（图3D和3E；图S3B）。Arglu1以前作为调节因子与雌激素受体介导的基因激活有关。由于RS结构域在剪接组分之间的相互作用中起着中介作用（Lin和Fu，2007），并且由于在我们的筛选中，物理上相关的因子通常具有相关的敲除作用，因此我们询问Arglu1和Srsf2是否可能通过相互作用相互对抗。在存在核酸酶处理的情况下进行共免疫沉淀，然后对HA-Arglu1和FLAG-Srsf2蛋白质进行western印迹，表明这些蛋白质可以相互作用（图3F）。因此，这些结果强调Arglu1是一种以前未知的剪接调节因子，可能通过物理拮抗Srsf2发挥作用。

染色质和转录因子起AS调节器的作用

在N2A细胞中，染色质/转录因子的敲除，包括具有PWWP基序、染色域和各种注释DNA结合域的蛋白质，其影响频率与剪接体相关蛋白和具有注释RNA结合或解旋酶域的附加因子的敲除频率相似（图4A和4B；图S4A）。例如，敲除含有pol-II的复合物的组分，包括核心pol-II亚单位，对As有显著的和强烈相关的影响，而敲除pol-II起始复合物因子TFIIB和TFIID有不同的影响（图3A；图S4B）。因此，AS受到暂时不同的pol-II复合体扰动的差异影响。染色体（SMC）结构维持蛋白的敲除也显著影响AS（图3A），这与先前SMC蛋白和剪接因子之间物理和功能联系的证据一致（McCracken等人，2005）。此外，调控组蛋白修饰的复合物组分（如PTIP-HMT、TLE1辅压子、含ING4和HBO1复合物）的敲除以及DNA修复（如BLM复合物III和BRCA1BARD1复合物）也显示出与as显著相关的作用。有趣的是，含有BRCA1的复合物先前已被证明在DNA损伤时可将剪接因子招募到基因启动子（Savage et al.，2014）。我们的结果支持BRCA1复合物在AS调节中的作用，并进一步与AS和不同DNA修复途径之间的联系起来。

锌指蛋白在AS调节中的广泛作用

值得注意的是，筛选数据显示57%（137/242）的含锌指（ZnF）结构域的因子敲除影响AS。在这些被分析的C2H2ZNF蛋白中，有42%（49/116）对N2A细胞中的AS有显著影响（图4A）。C2H2-ZnF蛋白是最大的一类核酸结合蛋白，包括人类基因组中的718个家族成员和小鼠基因组中的583个成员（Emerson和Thomas，2009；Tadepally等人，2008）。然而，虽然大多数分析的C2H2-ZnF蛋白与DNA结合，并且一个子集已被证明控制转录或沉默反转录转座，但这些蛋白质的绝大多数功能尚不清楚（Stubbs等人，2011）。

层次聚类（图4C）和主成分分析（图S4C）表明，敲除N2A细胞中的C2H2-ZnF蛋白以正或负的方式影响AS事件的不同亚群。一些最显著的变化与Gtf3a/TFIIIA、Yy1、Repin1和Rest/Nrsf的敲除有关，所有这些都曾被报道与RNA结合，此外，非神经细胞中神经发生基因的阻遏因子Rest的敲除，使几个AS事件的剪接模式与Srrm4的敲除方向相反（图S4C），这与我们先前的发现一致，即Rest转录抑制Srrm4，而Srrm4促进神经外显子的剪接，包括一个沉默静息活动的外显子（不懂）。

一个有趣的候选调节因子是Zfp871，它包含一个KRAB结构域和15个C2H2 ZnF结构域。敲除Zfp871以类似于Srrm4的方式影响富含神经的外显子（图4C）。此外，对ES细胞向谷氨酸能神经元分化的RNA序列数据的分析（Hubbard等人，2013）表明，Zfp871与Srrm4一样（Raj等人，2014），在神经元发育过程中表现出显著的表达增加（图5A）。为了进一步研究Zfp871的功能及其与Srrm4的关系，我们对敲除N2A细胞中每种蛋白质后的AS和mRNA表达变化进行了RNA-seq分析（图5B）。敲除Zfp871影响了479个外显子的剪接（PSI>10），其中189个是神经差异，198个与Srrm4调控的剪接重叠（均p<0.001，Fisher精确检验；图5B）。RT-PCR验证证实了SPAR-seq和/或RNA-seq检测到的所有10个分析的Zfp871依赖性和非依赖性神经差异事件的变化（图5C；图S5A）。与Srrm4类似（Irimia et al.，2014），敲除Zfp871主要减少短神经差异外显子的剪接，包括也受Srrm4调控的3-27 nt微酮（图5B）（p<0.001，Fisher精确检验30%nt外显子与更长外显子的重叠效应）。此外，受Zfp871敲除影响的AS事件基因在与神经元形态和功能相关的功能类别中显著富集（图5D）。

接下来我们研究了Zfp871调节神经分化和/或Srrm4依赖外显子的机制。与间接作用一致，敲降Zfp871会导致Srrm4 mRNA水平大约降低40%（即最终表达水平为60%），同时也降低了与神经AS相关的其他剪接调节因子的水平，包括Celf4、Raver1、Nova1和Ptbp2（图5E）。值得注意的是，使用单独的核苷酸解析交联和免疫沉淀结合测序（iCLIP），我们观察到Zfp871优先结合N2A细胞中其调节靶外显子附近的内含子序列，特别是与促进包涵体的外显子相邻的序列（图5F；图S5B）。结合占有率的增加并不是由于相应基因的表达增加或结合内含子的保留（数据未显示）。此外，Zfp871的绑定模式与Srrm4的绑定模式相似，在一个3’端剪接位点上游50个nt区域（Raj等人，2014）。与这一观察结果一致，Zfp871控制的外显子两侧是富含UGC基序的序列，它们代表Srrm4的结合位点（图S5C和S5D）。这些结果表明Zfp871通过影响Srrm4及其靶外显子的直接和间接机制控制神经AS，并且它还控制不受Srrm4调控的神经外显子。

Nacc1在多个水平调节ES细胞的分化

分析Zfp871的结果提出了一个有趣的可能性，即在我们的筛选中发现的额外转录因子/DNA结合蛋白也可能具有双重直接和间接AS调节活性。为了研究这一点，我们接下来重点研究了POZ/btbfamily转录因子nucleusaccumbernsassociated 1（Nacc1）。从筛选数据来看，Nacc1的敲除与Mbnl和Rbfox2的敲除具有强烈的相关性（图6A；图S6A），如前所述，其作为事件负调控ES细胞分化并控制体细胞重编程（Han et al.，2013；Venables et al.，2013）。此外，基因敲除RNA序列分析显示Nacc1对ES细胞分化有更广泛的影响，与BNL蛋白的敲除显著相关（r=0.76，图6B）。RNA序列数据进一步显示，Nacc1基因敲除降低了Mbnl1的表达，并在较小程度上降低了其他剪接调节因子的表达，包括Rbfox2（图6C），尽管在具有AS或敲除后表达变化的基因之间没有显著重叠（数据未显示）。与这些结果一致，对N2A细胞的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析表明，它与BNL1转录起始点的近端结合，但与BNL2或BFOx2基因的近端结合（图6D；数据未显示）。类似地，Nacc1峰通常在基因转录起始位点附近富集，在Nacc1敲除后表达改变，支持转录调节作用（图S6B）。总的来说，这些数据证明Nacc1通过调节Mbnl1和其他剪接调节因子的表达间接控制ES细胞的分化。

令人惊讶的是，Nacc1还结合其调控靶点周围的RNA序列作为事件。与Zfp871的结果相似，在N2A细胞中使用iCLIP分析，Nacc1经常与外显子RNA交联，但它也在其调节的靶外显子附近的内含子序列上显示丰富的占有率（图6E；图S6C和S6D）（p<10？5，所有比较，单侧Mann-Whitney U检验）。利用转染的野生型和突变体Nacc1构建物进行的交联免疫沉淀实验证实，Nacc1结合RNA，并进一步表明该活性主要依赖于位于POZ/BTB和BEN结构域之间的连接区（图S6E）。这些观察结果表明，Nacc1在控制ES细胞差异外显子的内含中起直接作用。

为了证实Nacc1是否对AS有直接的调节作用，我们检测了细菌表达的重组Nacc1在体外促进报告转录物中靶外显子剪接的活性。Nacc1浓度的增加刺激了Myo9b基因的一个替代外显子的包含，根据对敲除RNA序列和iCLIP数据的分析，该外显子受Nacc1调控（图6F；图S6F和S6G）。相反，添加可比较水平的重组PTBP1或BSA对剪接水平没有显著影响。此外，重组Nacc1不促进神经特异性外显子的剪接（图6G）。最后，与其RNA结合活性一致，Nacc1的连接区能够在体外促进外显子包含，尽管与全长蛋白质相比活性降低（图S6H）。然而，该结构域的缺失并未消除Nacc1的剪接刺激活性，表明至少在体外，蛋白质中的多个结构域可能形成促进外显子包含的相互作用（图S6H）。总的来说，这些结果证明Nacc1和Zfp871一样，在调节与细胞命运相关的AS事件中具有间接和直接的双重作用。

讨论

在这项研究中描述的SPAR-seq系统产生了一个高度定量的，基于序列的读数，用于响应数千个查询条件的几十个内源性调控事件。通过应用SPAR-seq发现与小鼠ES和神经细胞相关的控制细胞命运的调控网络，我们已经确定了与不同基因调控层相关的反式作用因子之间广泛的正功能和负功能相互关系。在神经细胞中一个意想不到的观察结果是，注释转录、染色质和DNA结合域蛋白的影响频率与剪接因子相似，并且这些蛋白因子的一个子集通过直接和间接机制双重控制与网络相关的细胞命运。

转录和染色质调节因子通过各种机制影响AS，包括随后影响新生转录物中AS的剪接成分的招募，以及通过改变竞争剪接位点暴露动力学控制AS的pol II延伸率（Braunschweig et al.，2013）。我们的结果证明，某些转录因子也通过与靶外显子相邻的RNA序列结合来调控AS网络，同时也影响控制相同靶外显子的剪接调控因子的表达。这些观察结果补充了越来越多的证据，表明缺乏规范RNA结合域的蛋白质，包括与转录和染色质调节相关的蛋白质，可以与RNA相互作用（Baltz等人，2012；Castello等人，2012；G Hendrickson等人，2016；Kwon等人，2013）。

值得注意的是，在我们的筛选分析中，超过50%的ZnF基因被敲除，对AS事件的不同亚群产生了显著的影响。ZnF蛋白质的特定种类，例如那些拥有CCCH型基序的，包括在RNA结合和调节中具有既定作用的成员（例如，U2AF1和MBNL蛋白质）。相反，虽然C2H2-ZnF蛋白是DNA结合蛋白中最大的一类，但只有很少的一部分蛋白具有这种作用。示例包括Gtf3a/TFIIIA（Layat等人，2013年）、HZF/Znf385a（Iijima等人，2005年）、CTCF（Saldan‘a-Meyer等人，2014年）、YY1（Sigova等人，2015年）和WT1（Hastie，2001年）。我们的结果为这类ZnF蛋白在剪接控制中更广泛的作用提供了证据。值得注意的是，在脊椎动物进化过程中，这类蛋白质的扩展部分是为了在转录调控和抑制快速进化的转座因子中发挥作用（Stubbs等人，2011），也可能出现调节与哺乳动物大脑等器官进化相关的AS日益复杂的模式（Barbosa-Morais et al.，2012）。

最后，我们证明了DNA结合和转录因子在RNA水平上多任务调节AS的范例扩展到了其他类型的蛋白质，如BTB/POZ结构域蛋白Nacc1。在本研究中更详细地研究了这两种因子在调节能力上的显著双重性，这表明额外的转录因子具有协调的调节功能，间接和直接地调节AS（图7）。SPAR-seq屏幕因此突出了注释转录因子和DNA结合蛋白作为as网络的先前未知调控因子的缓存，包括那些在细胞命运控制中具有重要作用的调控因子。对本研究中确定的剪接调控因子的进一步探索有助于发现在发育和疾病中起关键作用的AS调控机制和网络。此外，SPAR-seq系统的灵活性为在不同的其他机械和生物环境中实现非调节网络的全面透明打开了大门。

文献原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276517300370