【转发】人类B细胞的基因功能评估：健康和肿瘤细胞中基于CRISP
B淋巴细胞亦可简称B细胞，是来源于骨髓（bone-marrow）的多能干细胞，所以称为B细胞。其分化过程可分为前B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞、浆细胞等五个阶段。成熟的B细胞主要存在于淋巴结皮质浅层和脾脏的红髓和白髓的淋巴小结内。B细胞在抗原刺激下可分化为浆细胞，浆细胞可合成和分泌抗体（免疫球蛋白），主要执行机体的体液免疫（humoralimmunity）。近年来，随着生命科学和医学行业的兴起，人类对于疾病与健康更加关注，对于直接关乎机体的免疫功能的B细胞而言，其研究愈加火热。
众所周知，B细胞很难操纵，在静息状态下特别脆弱，这使得调节其基因内源性表达或诱导转基因过度表达变得非常困难。人类B细胞可以通过使用病毒载体进行操纵，然而该方法有诸多缺点。为了便于研究人类B细胞在健康和疾病环境中的基因功能，迫切需要稳健的遗传操作方案。近日，意大利锡耶纳大学，医学、外科和神经科学学院的 Federica Nardi和Laura Pezzella等人在European Journal of Immunology期刊上发表了题为Assessing gene function in human B cells: CRISPR/Cas9-based gene editing and mRNA-based gene expression in healthy and tumor cells 的技术报道类研究论文。在本研究中，作者建立了分别从健康人和血液病患者分离出的原代B细胞中进行高通量mRNA驱动的转基因表达和基于CRISPR/Cas9的基因敲除流程。基于静息状态下的人体B细胞进行电穿孔实验的稳健操作方案，克服了B细胞难操纵的障碍，这将显著加速B细胞研究的潜力。
mRNA在传递中作为质粒转染的一种无毒替代物，已应用于一系列脆弱的原代细胞。体外重组纯化的Cas9和合成的sgRNA形成的核糖核蛋白（RNP）复合物的电穿孔是一种易于设计的CRISPR/Cas9基因编辑。
在本次实验中，研究人员使用NEPA21基因转染系统对来源于健康人和血液病患者分离出的原代B细胞进行电穿孔实验并将携带绿色荧光蛋白的mRNA导入到细胞内，用以观察基因的表达和转染效率。研究人员设置了12次电穿孔条件，最佳的条件使的在电转后B细胞的存活率>90%，mRNA的转染效率>90%（图1A–C）。解冻冷冻保存的B细胞也观察到相似的电穿孔效率（>90%），但其细胞存活率稍低（85%），从而证实电穿孔条件与细胞冷冻保存条件相容。蛋白质过度表达可以通过调节mRNA剂量轻松控制（图1D），通常在电穿孔后96小时通过绿色荧光蛋白反应才能检测到结果（图1E）。我们还检测了通过尿苷-上半尿苷替代导致mRNA免疫原性降低的mRNA结构的化学修饰是否会对B细胞转染效率产生积极影响。然而，我们没有观察到使用含尿苷的mRNA的显著优势。
随着电转技术在B细胞的应用与发展，研究人员建立了一条分子生物学实验线，允许以高通量的方式过度表达编码大量转基因的mRNA。研究者们建立了一个5步法程序，以产生以96孔格式编码任何给定转基因的mRNA（图1F）。它包括（1）基因特异性引物的自动设计，（2）从任何合适模板扩增转基因的第一个PCR反应，（3）将纯化的PCR产物Gibson连接到含有体外转录所需元素的修饰的dRNA2支架上[2]
（4） ，第二次PCR扩增与转基因C末端的FLAG标签融合的体外转录模板，以及（5）mRNA的体外合成。这种方法可以快速、廉价地生产出纯化的mRNA为电穿孔做准备。为了进行实验验证，可以通过使用抗Flag标签抗体（图1G）进行免疫印迹来方便地验证转基因过表达，经验证，mRNA电穿孔B细胞可用于任何体外或体内检测。
图1：人体B细胞中基于mRNA的转基因过表达。（A）B细胞电穿孔后的活力和转染效率。用5μg GFP mRNA和100μL体积的B细胞进行电穿孔实验，并在AIM-V中培养过夜。最佳设置以黄色突出显示。（B）流式细胞仪分析结果和（C）B细胞的活力和转染效率，按最佳设置（n=6次实验）进行。（D） 使用不同剂量的GFP mRNA进行B细胞电穿孔的示例，显示转基因过度表达如何通过mRNA剂量进行微调。（E） 电穿孔后24和96小时mRNA电穿孔B细胞中绿色荧光蛋白信号的流式细胞术分析。面板（D）和（E）是代表至少三个独立实验。（F） 体外进行mRNA合成及扩增的工作流程。（G）体外mRNA的产生和免疫印迹的示例图（IB）电穿孔后24小时，在B细胞中检测到的FLAG标记的转基因。
此外，为了开发B细胞中KO基因的管道，研究人员优化了培养实现稳健的B细胞增殖的条件，这是实现基于Cas9的基因编辑的高效性所必需的，对于活力和增殖能力低的B细胞（如CLL细胞）来说尤其具有挑战性。我们观察到B细胞对细胞拥挤效应特别敏感，必须以不超过1—2×105个细胞/mL的密度进行电转。在通过BCR、CD40和IL-4/IL-21刺激B细胞以及对培养物基中细胞板数的优化，使我们能够在5-6天内对所有测试样本实现三到五轮细胞分裂。
为了通过CRISPR/Cas9方法建立B细胞KO基因的方案，如图2A所示的流程。研究人员用较稳定的聚谷氨酸RNPs电穿孔B细胞，并使其在电穿孔后5-6天内增殖，这通常使我们在大量人群中获得>70%的基因KO（图2B和C）。KO表型可在电穿孔后第3天观察到，并在B细胞内扩增后进一步增强（图2D和E）。靶向CD19基因被证明是有用的内部控制，可通过流式细胞术进行简单评估（图2B），而敲除细胞周期调节因子CDC5L（可导致B细胞分裂停滞）可作为B细胞增殖试验的对照（图2F）。总之，我们的结果表明，为了在静息B细胞中实现CRISPR/Cas9高靶向效率，有必要且足够的使用优化的电穿孔（NEPA21基因高效转染系统）条件来递送Cas9 RNP，然后培养B细胞以诱导其增殖。
图2：人体B细胞中基于Cas9 RNP的KO基因。（A） 人体B细胞中基于CRISPR/Cas9的基因编辑工作流程。（B） 代表性实验和（C）显示RNP切除后第5天B细胞表面受体CD19（n=10）或ILT3/LILRB4（n=6）KO的实验总结。（D） 电穿孔后72小时和120小时，B细胞中CD19 KO的分析。（E）面板D中： CD19染色组织覆盖情况。（F）CDC5L KO后阻断B细胞增殖。数据点为平均值±SD。（D–F）所示数据代表五个（D，E）和三个（F）独立实验**p<0.01，****p<0.0001（Mann–Whitney检验）
最后，为了使该方法适用于高通量筛选程序，研究者们建立了30 μL电穿孔体积的电穿孔条件，其中所有试剂和细胞数量按比例缩小。这种方案降低了对细胞和试剂的消耗，同时实现基因过度表达和基因KO的高效率。因此，本研究中的方法学流程阐明了一种可扩展的方法就是利用体外生产的mRNA或合成的靶向RNA序列评估不同来源的静息人类B细胞的基因功能。该流程的优点包括在不影响细胞的存活率和不需提前扩增的情况下，能够以高通量方式评估人的原代B细胞中的基因功能，并且可以直接在大量人群中进行应用。还提出了另一个工作流程，就是类似的方案也适应于其他电穿孔系统，并最终适应其他类型的脆弱原代免疫细胞。
论文链接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.202149784
参考文献
1、Nardi, F., Pezzella, L., Drago, R., Di Rita, A., Simoncelli, M., Marotta, G., Gozzetti, A., Bocchia, M. and Kabanova, A. (2022), Assessing gene function in human B cells: CRISPR/Cas9-based gene editing and mRNA-based gene expression in healthy and tumor cells. Eur. J. Immunol., 52: 1362-1365. https://doi.org/10.1002/eji.202149784
2、 Vriens, K. et al., Nature. 2019. 566: 403–406.
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