写在前面

硕士毕业做的大豆内参基因的筛选，当时用了geNorm, NormFinder和BestKeeper三个软件，geNorm 不需要多说，Vandesompele教授的奇作，自2002年发表至今被引用14000多次

geNorm被引用信息
而后商业化被整合到qBase+，需要大概220欧... 当然网上自然有crack的版本，大家各显神通把，BestKeeper则没有什么大变化，还是一个基于excel2003 VBA开发的一个算法，也木有更新，想对于geNorm和NormFinder来说算法简单，只是对Raw Ct value做了pairwise correlation，所以参考的意义其实不大，对于候选内参较少的情况（<10个）可以进行粗筛。NormFinder就显得良心多了，由于NormFinder考虑了inter-和intra-group的因素，所以在样品多分组的qPCR assay中NormFinder的评测结果可能要比其他软件好，在office版本更迭后在2015年推出了基于R的算法，甚至没有打包成package，使用方法也比较简单，下面就介绍一下如何实现两行代码搞定内参筛选。

准备

• 首先下载这个文件r.NormOldStab5.txt，这个文件就是R版本的NormFinder了。详细参考NormFinder官方网站，当然CL Andersen 的大作从04年至今也有了4225的引用量。NormFinder文章
• 然后在你的电脑中新建一个文件夹，命名为NormFinder，然后将下载的r.NormOldStab5.txt粘贴进来。
• 对于完全不知道怎么用R的建议用Rstudio具体安装方法:R和Rstudio安装方法, 打开Rstudio，点击左上角的绿色小加号新建一个R script，绿色框是R script，就是以后写代码的地方，下面的叫console（控制台）一会软件计算的结果会在console中展示。
  image.png

• 然后点击菜单栏上的session→set Working Directory→Choose Directory然后选择你刚才新建的NormFinder的文件夹。然后在R script 下方的 R console中会显示下面代码

>setwd("~/software/NormFinder")

说明你的工作目录已经转换到了你刚才新建的NormFinder“文件夹”下，
然后在上面R script输入

source("r.NormOldStab5.txt")

然后点 R script面板上右上角绿色的小箭头，会提示run current line or selection。

• source以后 NormFinder这个命令就可以使用了，然后就是输入数据。数据输入格式如下:
  输入数据格式

纵向的rowname是candidate reference gene， 第一列的colname是样品的名称，最后是分组，比如case 和 control.中间是Raw Ct值，当然也可以根据老版本的说明做2 ^{-delta Ct}的归一化处理。当然这里的不同就意味着后面在查看结果时使用的代码也不同。这个数据是我通过excel函数 =RANDBETWEEN(13,30)随机生成的模拟Ct值。将自己的数据整理成这种格式后用excel保存，注意保存的时候将格式改为制表符分隔符的文本文档.txt格式，而不是UTF-16 Unicode的文本文档格式，这里我和manual中一致改成的Datafile.txt。然后同样保存到刚才新建的NormFinder文件夹下。然后输入:

Result=Normfinder("Datafile.txt")
##如果你输入数据格式是未分组的格式输入下面代码,如果不是就不要运行。
Result1=Normfinder('Datafile.txt', Groups = FALSE)

运行完你会在右边environment的Data中发现多了一个Result，而这个result是一个list，这个list下面就保存了所有的结果信息，主要包括了Ordered, UnOrdered, PairOfGenes三个结果，也就是按照stability 排序后，未排序的筛选结果，以及最稳定的内参基因组合的结果。

文件的保存

思路就是将list中的结果分别命名然后再write.csv。 代码如下

Ordered_result = Result$Ordered
UnOrdered_result = Result$UnOrdered
PairOfGenes_result = Result$PairOfGenes
write.csv(Ordered_result,file = "Orderd.csv")
write.csv(UnOrdered_result, file = "UnOrdered.csv")
write.csv(PairOfGenes_result, file = "PairOfGene.csv")

一顿操作过后你会发现在你新建的NormFinder文件夹中出现了如下结果文件:

结果输出
对于结果的解读就不介绍了，文献多如牛毛，自己把握。最后附上R版本NormFinder的manual，基本就是简单翻译了一下，做一个杜师兄当年提倡的脑残版protocol