Nature Protocols：用于神经发育后期研究的高级大脑

类脑器官是一种新兴的技术，为人类大脑发育提供了一个窗口，可以依靠新兴技术建立大脑发育和疾病模型。这种类脑器官是在体外培养的，这使它们容易应用在遗传学或者活体荧光成像等实验中。最早期的体外类脑研究使用的是来自多能干细胞(PSCs)定向二维分化的人类神经元。后来通过对3D胚状体的神经诱导形成皮质样结构。这里介绍一种生成端脑特征的大脑类器官，并在神经发育后期(包括轴突生长和神经元成熟)保持长期生存能力的方法。该方法建立在早期大脑类器官方法学的基础上，通过修改胚状体的大小和形状来增加表面积和切片培养，以保持营养物质和氧气进入类脑器官内部区域，使其能够长期培养。并且该类脑器官还可引入外源质粒和细胞标记的方法，以随时间成像神经元轴突的生长和成熟。此方法允许建立皮质发育后期的模型，这对神经发育性疾病建模非常重要。该方法由具有干细胞培养经验的实验人员执行，可在2个3个月来完成具有数月成熟期的类器官。

方法概述

这里简要介绍以下这种类脑器官的产生和长期培养方法和其应用前景。首先将人多能干细胞从其底物上解离出来，并重新聚集为漂浮的胚状体。然后有两种增加胚状体的表面积-体积的方法：小胚状体或纤维微支架。然后，将这些经过修饰或改造的胚状体依次通过一系列培养基进行处理，其条件类似于原始的脑类器官方法，但营养成分和时间安排略有改善。嵌入基质液滴并在轨道振荡器上进行搅拌培养。在神经上皮芽建立良好后去除基质胶，因为基质胶的存在会损害适当的分层。神经发生确立后，基质胶作为溶解成分在培养基中提供。皮层板形成后，将类器官用于切片培养，并在气液向界面中长期保存。

应用   

这里描述的类脑器官形成方法，可用于研究人类神经发育和功能的基本机制以及神经发育和神经疾病的发病机制。形成分层皮质小叶的类脑组织提供了一种系统，用于检查脑形态发生过程和影响这些过程的疾病，例如小头畸形。在神经元定位方面的改进还使得该类脑器官能够研究神经元迁移的缺陷，例如神经元异位症。另外，此方法避免了生长因子和小分子的大量使用，其产的细胞类型是根据机体内在的发育程序和时间产生的。例如，有报道称生长因子LIF的使用促进胶质发生的转变，因此应用该因子可能人为加速向胶质细胞的转变。事实上，如果不使用LIF，健康、成熟的星形胶质细胞直到4-5个月才大量生成。它们还可用于在脊髓损伤或变性的情况下的神经连接受损情况。良好的存活率和静态培养使其能够进行电生理学研究，例如多电极阵列记录，从而有可能对神经元网络成熟进行长期研究。

总结

这里我们对这一方法进行简要的介绍，具体的实验步骤，试剂及仪器的准备，本方法的局限性以及操作中问题的应对，大家可以参考原文：

Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development（https://doi.org/10.1038/s41596-020-00433-w）