细胞周期的检测方法

细胞周期（cell cycle）是指从细胞分裂产生的新细胞生长开始，到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的时间，代表生命从一代向下一代传递的连续过程。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

细胞周期主要分为：DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和细胞分裂期（M期）。G1期主要合成RNA和核糖体，细胞体积明显增大。S期除了合成DNA外，还要合成组蛋白以及DNA复制所需的酶。G2期是有丝分裂的准备期，DNA合成终止，大量合成RNA包括微管蛋白和促成熟因子等。M期细胞分裂，DNA由二倍体重新成为一倍体。

细胞周期的检测方法

测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、流式细胞仪法、基于细胞成像的荧光检测法等。

1.同位素标记法

标记有丝分裂百分率法 (PLM) 是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。

检测原理：

① 待测细胞经 3H- 胸腺嘧啶核苷标记后，所有 S 期细胞均被标记。

② S 期细胞经 G2 期才进入 M 期，所以一段时间内 PLM = 0。

③ 开始出现标记 M 期细胞时，表示处于 S 期最后阶段的细胞，已渡过 G2 期，所以从 PLM = 0 到出现 PLM 的时间间隔为 G2期的持续时间。

④ S 期细胞逐渐进入 M 期，PLM 上升，到达到最高点的时候说明来自处于 S 最后阶段的细胞，已完成 M，进入 G1 期。所以从开始出现 M 到 PLM 达到最高点 (≈ 100%) 的时间间隔就是 M 期的持续时间。

⑤ 当 PLM 开始下降时，表明处于 S 期最初阶段的细胞也已进入 M 期，所以出现 LM 到 PLM 又开始下降的一段时间等于 S 期的持续时间。

2.流式细胞仪 PI 染色法

细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 与 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能 ( G0 期 )。

检测原理：由于细胞周期各时相的 DNA 含量不同，通常正常细胞的 G1 / G0 期具有二倍体细胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍体细胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与 DNA 结合，其荧光强度直接反映了细胞内 DNA含量。因此，通过流式细胞仪 PI 染色法对细胞内 DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

流式细胞周期检测注意事项：

① 建议选择6孔板操作，细胞给药密度在60%左右，但如果收样时，孔内细胞已经明显观察到细胞漂浮凋亡，那对流式检测的结果会有很大的影响。流式细胞术收样时，尽量保证孔内细胞还未漂浮。

② 收样时，如果孔内已经有细胞漂浮，细胞上清悬浮液也要收集。建议选用胰酶消化，消化时间必须严格控制，及时终止消化，消化时间太久，容易对细胞造成损伤和死亡。

③ 收集细胞时，离心机选用4℃，350×g离心5分钟，小心吸去上清。加入1mL预冷的PBS，用手指将管内的细胞弹匀，再加入3 mL预冷的3 ml无水乙醇(-20℃预冷)中，边加边高速搅拌。-20℃固定过夜。整个收样过程中，不要用枪头吹打细胞，一是会损伤细胞，二是造成细胞损失。

④ 进行实验时，首先4℃，350×g离心5分钟，弃去乙醇溶液此时格外需要注意的是，离心后细胞不是全部沉淀在管底，管壁上也会存在大量细胞，去上清一定要注意。加入周期试剂盒的染色液，避光染色30分钟以上，上机测试前最好使用200目筛网过筛，以免细胞聚集堵塞机器管道。

3 . 基于成像的荧光检测法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鉴别细胞处在细胞周期的哪一时期，因此可以用来研究癌症细胞周期的进程。FUCCI 技术建立在鉴定过表达的两种调节细胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是绿色荧光基团 AmCyan，而 Cdt1 融合的是红色荧光基团 mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平随着细胞周期的变化而不断波动：Cdt1 蛋白水平在 G1 阶段达到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不断升高。这一结果体现为表达 FUCCI 细胞核在G1 期为红色而在 S，G2 和 M 期则呈现绿色。

检测方法：A375S FUCCI 球体准备的方法如下：Corning 公司 96 孔 U 型底低吸附细胞培养板中加入含有 EGF (20 ng / mL) 和 B27 (1×)的 DMEM / F 12 培养基，按每孔 1,000 细胞进行种板。细胞板离心 (800 g,6 min) 后在 37 ℃，5% CO2条件下进行孵育。最后，用含 10% FCS 的培养基清洗球体 3 次以移除 EGF 和 B27，继续培养 1 至 6 天。