03.单细胞数据质控及降维标准流程
背景知识：
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线粒体基因表达比例：
- 线粒体基因参与细胞凋亡的启动，因此垂死细胞会体现出线粒体基因表达比例的上升。
- 在我们使用组织块制作单细胞悬液的过程中，会造成部分细胞细胞膜的破坏，这时细胞质中的转录本会大量流失，而线粒体和细胞核中的转录本不便，检测时就会表现出大量比例的线粒体基因表达。
- 线粒体基因通常为
MT开头，我们在下面处理中会使用正则表达式以计算这一系列细胞的表达百分比作为质控指标。
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当制备单细胞悬液时，如有两个或多个细胞未解离的情况下，后续检测结果中会出现某一细胞所检测到的基因数和UMI数量的倍增。
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在某些数据中，还需根据检测目标和情况进行其他指标的筛选，例如红细胞的剔除、细胞周期的选定等。。。
我们对数进行质控的过程就是对上述指标进行阈值的设定以剔除我们不需要的数据，避免对下游分析的影响。但，各项指标阈值设定为多少？需要对那些指标进行筛选？是没有一个统一的定论的。例如由于样本来源的差异，必然会导致测得的基因数、UMI总数、线粒体比例的不同，这时我们就要大量阅读所做样本的相关文献，找一个普遍性的阈值或根据对数据进行可视化之后查看样本分布情况，剔除离群样本。
我们用pbmc3k数据集进行代码流程演示。强烈建议仔细阅读seurat官网指南。
library(Seurat)
library(SeuratData)
library(ggplot2)
library(patchwork)
library(dplyr)
load(file = "pbmc.rdata") #Seurat对象读取
pbmc
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-") #计算线粒体基因百分比
#小提琴图可视化质控指标
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
image
nCount_RNA：每个细胞的UMI数量nFeature_RNA：基因数percent.mt：线粒体基因百分比在实际处理中，往往GEO存储的都为质控好的数据或在上游cellranger处理后进行了过滤。
# 计算两特征之间的关系
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2
image
这里主要是计算了两个指标之间的相关性，个人理解count和feature应该有较强的共线性，而mt比例应无较强相关性。
#设定各指标阈值使用subset函数取子集
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5) #这里使用的标准为nFeature_RNA：200-2500，percent.mt < 5
到这里质控的流程就基本结束了，结束后我们也可以重复上面的可视化过程来对质控结果进行验证。
Seurat降维标准流程
由于单细胞测序每个样本都会存在数千个细胞，而每个细胞都会有最高上万个所测基因表达量。
因此，为了后续分析的效率和可行性，我们对数据进行降维的操作。先鉴定出细胞中的高变基因（在各个细胞中的扰动较大），仅仅对细胞分群维度有贡献的高变基因进行后续PCA，仅保留贡献度较大的PCs用于细胞亚群的鉴定。
主要流程：寻找高变基因——PCA前的scale——PCA——可视化降维t-sne/umpa
个人理解：
寻找高变基因的意义：减轻PCA的运算压力并有利于PCA的降维。
PCA前的scale：是PCA之前的标准流程，线性转换所有基因表达使细胞间的平均表达值为0。 缩放每个基因表达，使细胞间的方差为1。此步骤使每个基因在PCA中获得同等权重，防止某一高表达基因占主导地位导致PC鉴定的偏差
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 1e4) #对数据进行标准化
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = 'vst', nfeatures = 2000) #寻找高变基因
# 找出前10高可变基因用于后续可视化
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
# 高变基因可视化
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2
image
我们在做的时候可省略可视化步骤
#PCA前的scale和PCA
pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc)) #默认最大PC数为50，可查阅函数help自行修改参数
PCA流程结束。我们需要挑选合适的PCs进行后续的细胞亚群鉴定
这里官方给出了两种方法，JackStraw()和ElbowPlot()
pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)#JackStraw方法
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15) #可视化前15个PC
ElbowPlot(pbmc)#肘型图
##默认都是计算50个PC可根据需求调整参数
image
JackStraw()主要是根据查看PC的P值来进行筛选，最佳PC应该为PC的p-value突然开始明显变大的那个PC。个人体会，这种方法计算量巨大，如果数据集比较大计算时间很长，而且结果很难分辨，不做推荐
image
肘型图的结果也比较难以分辨，按我们之前的认识应该选取拐点出，7或8，但官方在下游却设定为了10。
实际上该选择多少并没有一个明确的规定，往往只能通过继续向下游分群注释去做，出现问题了回来调整或者往下做之后更换几个PC再做一次看结果的重复性是否良好
这里推荐一个技能树jimmuy写的一个方法来确定最佳PC数量，关于详细的解释，这里不赘述。我们就根据官方给定的PC继续下游处理
# 细胞聚类
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10) #这里dim填入选择的PC数量
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5) #分群粒度根据总细胞数量选取，一般为0.4-1.2，粒度越大分群越多
head(Idents(pbmc), 5)
table(pbmc$seurat_clusters)
##UMPA流程并进行分群可视化
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)#与上面的PC要一致
DimPlot(pbmc, reduction = 'umap')
image
到这里我们的单细胞数据质控，降维标准流程就结束了，后续就是堆细胞亚群的注释。在后续的注释过程中也会发现各种问题，这时候就需要对上面选择的PC、分群粒度进行调整来对亚群进行细分或合并。
参考来源：
https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html
http://t.zoukankan.com/emanlee-p-14932294.html
https://www.jianshu.com/p/a77b8e7dc76d
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Email: xuran@hrbmu.edu.cn
