技术介绍 | 详解 ATAC-Seq

ATAC-seq，全称 Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing，是 2013 年由斯坦福大学 William J. Greenleaf 和 Howard Y. Chang 实验室开发的用来研究染色质可及性（通常也理解为染色质的开放性）的方法。

真核生物的核 DNA 并不是裸露的，而是组蛋白与之结合。DNA 一圈一圈地缠绕在 8 个组蛋白上，形成核小体，每个核小体占了约 147bp 的 DNA。一个个核小体构成了串珠样的结构，然后进一步折叠、聚合，并在其他架构蛋白的协助下，形成染色体。这样就能将超长的 DNA 链，折叠成很小很小的结构，塞进小小的细胞核里。

但是在基因转录的过程中，并非需要完全解开 DNA 链的全部结构，而是只需部分解开，即表达基因的区域。这一步骤主要依赖于染色体组蛋白的修饰，尤其是乙酰化。被打开的染色质称为开放染色质（open chromatin）。一旦染色质打开，调控蛋白（例如转录因子）就有机会结合其中。染色质的可及性是指染色质打开的特性，主要由染色体组蛋白的修饰实现，因此染色质的可及性反映了调控因子与开放染色质结合的程度，与转录调控密切相关。通过研究特定细胞状态下开放的染色质区域，我们能够在 DNA 水平上了解其转录调控机制。

研究开放染色质区域的技术

传统的实验方法主要包括 MNase-seq 和 DNase-seq，它们的主要思路是：当染色质变得开放时，DNA 和组蛋白的聚集程度降低，导致一部分 DNA 暴露出来。失去蛋白质的保护后，这部分 DNA 可被 DNA 酶（如 MNase 或 DNase I）切割。随后，我们对切割后的 DNA 进行测序，并将其与已知的全基因组序列进行比较，以确定哪些序列被切割，哪些基因序列未受影响，从而确定开放的染色质区域。但是这两种方法存在明显的缺陷，主要表现在耗时费力和重复性差的问题。

还有 FAIRE-Seq，先进行超声裂解，然后用酚-氯仿富集，不依赖酶和抗体，但弊端就是检测背景高，测序信噪比低，甲醛交联时间不好把握等等。

ChIP-Seq 是揭示特定转录因子或蛋白复合物的结合区域，实际是研究 DNA 和蛋白质的相互作用，利用抗体将蛋白质和 DNA 一起富集，并对富集的 DNA 测序。

整体的分析思路一致，这些技术找富集区域，对富集区域进行功能分析。

相比起来，ATAC-seq 是用 Tn5 转座酶，操作起来也更加简单，重复性好，而且最重要的一点是实验只需要很少的细胞/组织量，出来的信号也更加漂亮，所以 ATAC-seq 目前已经是研究染色质开放性首选的技术方法。

ATAC-seq 技术

ATAC-seq 技术用到了一个转座酶 Tn5：DNA 转座是一种由 DNA 转座酶介导，把 DNA 序列从染色体的一个区域插入到另外一个区域的现象，类似于“剪切粘贴”。这个过程，也是需要插入位点的染色质是开放的，否则就会被一大坨高级结构给卡住。

转座酶可以随机结合并切割染色质开放区的 DNA，并且可同时在切割位点插入接头序列。只要将携带已知 DNA 序列标签的转座复合物（即带红色和蓝色序列标签的 Tn5 转座酶）加入到细胞核中一起孵育，再利用已知序列标签进行 PCR 扩增即可形成文库，经过测序就可以获得染色质开放区的信息。

ATAC-seq 实验流程

一般来说包括以下几个步骤：

• 细胞核制备

• 片段化及 DNA 提取

• PCR 扩增

• 文库纯化

• 高通量测序

• 数据分析

ATAC-seq 技术的优势

• 所需细胞量较低，而且信噪比高、特异性强、耗时短

• 满足动物、植物、人等样本的要求，具有很好的物种适应性

• 单细胞测序技术是近几年研究的热点，通过对单个细胞的测序能够将表观遗传学研究个体化。常见的 ChIP-seq、DNase-seq、MNase-seq 等技术无法进行单细胞测序，而 ATAC-seq 经过实验验证，表明其能够进行单细胞测序

ATAC-seq 技术的应用

那么说了这么半天的 ATAC-seq 归根到底是用来干嘛呢？主要有以下应用

• 染色质开放性图谱绘制，表观基因组图谱

• 找调控生物学过程的关键转录因子

• 找哪个转录因子调控了研究的基因

• 找转录因子调控的靶基因

• 得到不同组织或不同条件下对应可及性区域。

• 得到核小体位置

• 生成转录因子结合区域的特征 (footprinting)

ATAC-seq 适用于机制研究，探索信号通路、表型变化、疾病等与基因调控的相关性。并以其简便高效、重复性好等优点，成为研究染色质开放区的有效技术方法。

在表观遗传研究中，ATAC-seq 能够探索表观修饰是否与研究目标有相关性，可通过 Open Chromatin 区域和 Motif 分析寻找参与基因调控的转录因子。ATAC-seq、CUT&Tag 和 RNA-seq 等方法技术能够助力科研人员进行相关研究

ATAC-seq 的技术限制

• Tn5 通过插入剪断 DNA 并将测序接头连接到剪断的两个 DNA 片段的末端，因此对于一个 DNA 片段而言，其两端的接头连接是随机的，导致同一片段两端的接头有 50%的概率是同一接头。而只有连接不同接头的片段才可用于富集扩增及测序，因此一半的片段无法利用

• 大量剪断的 DNA 由于片段过大，无法进行 PCR 富集

• Tn5 的活性受反应溶液的组成及反应条件影响，仍然需要优化以便提高剪切效果

• ATAC-seq 在植物细胞存中存在细胞壁、叶绿体线粒体等细胞器污染，缺少稳定遗传的细胞系等问题

参考资料

• 表观遗传学研究利器——ATAC-seq 技术，高效探索染色质开放区

• 一文详解 ATAC-seq 原理+读图：表观遗传的秀儿

• ATAC-Seq 基础分析+高级分析+多组学分析

• 维基百科-染色体

• 一文了解 ATAC-seq

• 单细胞 ATAC 测序

• 表观组学专题：ATAC-seq, 你了解多少呢

• ATAC-seq

• ATAC-seq 学习记录

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