弥漫性B细胞淋巴瘤的肿瘤细胞状态和生态系统(单细胞空间)

周三了，时光飞逝，不知不觉一天天过去了，看来时间是有加速度的，越来越快，这一篇我们来分享弥漫性大B细胞淋巴瘤的研究进展，这是淋巴细胞瘤，不同于实体肿瘤，文章在The landscape of tumor cell states and ecosystems in diffuse large B cell lymphoma，发表于Cancer Cell，方法和内容都很经典，我们来分享一下。

文章作者开发了EcoTyper（这个方法非常重要，大家可以参考我之前的文章10X单细胞空间数据分析之表征细胞状态和生态型（EcoTyper）、10X单细胞空间数据分析之表征细胞状态和生态型（EcoTyper示例代码）），一个整合了转录组解构和单细胞RNA测序的机器学习框架，用于描述临床上相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞状态和生态系统。使用这种方法，研究人员确定了恶性B细胞的五种细胞状态，它们在预后关联和分化状态上有所不同。研究人员还确定了组成肿瘤微环境（TME）的其他12个谱系细胞状态的显著变化，并在定型的生态系统中形成细胞状态的相互作用。

SUMMARY（总结一下）

• EcoTyper, a machine-learning framework integrating transcriptome deconvolution and single-cell RNA sequencing, to characterize clinically relevant DLBCL cell states and ecosystems（10X单细胞空间数据分析之表征细胞状态和生态型（EcoTyper）、10X单细胞空间数据分析之表征细胞状态和生态型）.
• 肿瘤异质性和微环境的相互作用

INTRODUCTION

• 最常见的血液系统恶性肿瘤，弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL)，是成熟 B 淋巴细胞的肿瘤，具有显著的临床和生物学异质性。

• 除了恶性肿瘤 B 细胞的分子特征外，还已知反映 DLBCL 肿瘤微环境 (TME) 中不同非恶性细胞类型的分子特征会影响观察到的疾病生物学和临床异质性（肿瘤和微环境的相互作用，这个是研究肿瘤最为重要的一环）

• DLBCL TME 中临床相关的转录异质性仍然不明确，特别是与 COO（cell of origin） 相关，目前缺乏对 DLBCL TME 的大规模系统分析（单细胞技术、EcoTyper的分析方法）。

RESULTS

High-throughput cell state discovery and ecosystem profiling in DLBCL

关于EcoTyper的原理、方法、代码之前全部分享过，大家可以参考文章10X单细胞空间数据分析之表征细胞状态和生态型（EcoTyper）、10X单细胞空间数据分析之表征细胞状态和生态型

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Atlas of DLBCL B cell states across 1.6k tumors

• EcoTyper identified five B cell states in DLBCL tumors, including several with characteristics of GCB（germinal center B cell-like） or ABC（activated B cell-like） subtypes。

• EcoTyper implements a supervised approach for mapping single-cell transcriptomes to pre-defined cell states and for evaluating the significance of cell state recovery。

• 在确定了 DLBCL 中的五种 B 细胞状态后，接下来研究了它们与突变模式和总生存期 (OS) 结果的关系。

尽管 B 细胞状态和突变类别之间缺乏强烈的一致性，但所有五个状态都对生存进行了分层。 此外，与预期一致，具有最强大的 COO 富集（S1 和 S5）的州在单变量生存模型中预测了有利的（S1）和不利的（S5）结果。 重要的是，在对 COO、LymphGen 或 C1-C5 类别进行多变量调整后，几个状态也预测了 OS，包括状态 S5（一种 ABC 富集状态）和状态 S2（一种具有混合 COO 表达的表型）

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Clinically distinct developmental trajectories of DLBCL B cells

• We first asked whether all five states were recoverable in normal B cells isolated
  from human lymph nodes, using marker genes defined from DLBCL tumors。

• 五种状态的B细胞都在正常细胞中存在，而且We observed specificity of S1 for germinal center (GC) B cells, S2 and S3 for pre-memory B cells, S4 and S5 for pre-plasmablasts, and S4 for light zone B cells（每种状态的B细胞都有其独特的来源）

• 抗原激活的GC B细胞在 dark 区增殖并发生体细胞超突变，在 light 区进行选择，在 light 区和 dark 区之间经过数轮后，分化为记忆B细胞或浆母细胞。applied Cyto-TRACE to predict developmental orderings based on singlecell transcriptional diversity（关于cytotrace，大家可以参考我的文章10X单细胞轨迹分析（拟时分析）之cytotrace）

• As expected, S1 (GC-like) was predicted to be least differentiated while the remaining states were predicted to be more differentiated。Accordingly, we hypothesized that malignant B cells might display a similar hierarchy.

• To investigate DLBCL development with single-cell precision, we integrated EcoTyper states with paired scRNA-seq and scVDJ-seq profiles of four de novo DLBCL tumors (three ABC and one GCB). We then imputed genome-wide copy-number variants (CNVs，这个地方对恶性B淋巴细胞做CNV分析，再次证明了B细胞会发生CNV事件，大家可以参考我的文章10X单细胞空间全面剖析早期胃癌进展中的免疫微环境) and cross-referenced cellular barcodes with immunoglobulin VDJ repertoires. The latter were concordant with those determined by targeted DNA sequencing

• 此外，在所有四个 DLBCL 标本中，通过 scVDJ-seq 检测到与通过拷贝数分析鉴定的恶性细胞一致的单一显性 BCR 克隆型。

在 GCB 肿瘤中，恶性细胞非常普遍，在包括状态 S1 在内的所有状态中都有代表性。 然而，在三个 ABC 标本中，恶性细胞分布在 S2-S5 中，但在 S1 中基本上不存在。 在通过 scRNA-seq 分析的另外三个 DLBCL 肿瘤中，在 GCB（n = 2）中也可检测到 S1，但在 ABC（n = 1）中未检测到，而其余状态几乎存在于每个肿瘤中。 在 1,133 个bulk肿瘤中观察到相同的模式，揭示了 ABC 样肿瘤中 S1 的显著消耗，但在几乎所有 DLBCL 肿瘤中都有剩余四种状态的证据。 重要的是，状态特异性亚克隆在任何肿瘤中均不明显，表明 B 细胞可能在肿瘤转化后继续分化。

总的来说，这些数据与“叉骨”模型一致，其中 GCB DLBCL 肿瘤出现在 S1，而 ABC DLBCL 肿瘤主要出现在 S1 的下游，但在致力于 GC 衍生的记忆 B 细胞或浆母细胞谱系的细胞的上游。值得注意的是，这个模型代表 一个伪时间排序，并不意味着前记忆 B 细胞和浆母细胞谱系同时与 GC 前体分化。 此外，一些 B cell 表型可以表现出发育可塑性，强调了替代轨迹的可能性。 然而，当沿着正常 B 细胞发育的两个轴进行可视化时，恶性 B 细胞转录组沿着与它们预测的个体发育、它们的状态表示和它们的 COO 状态一致的叉骨结构组织。 总之，这些发现进一步阐明了 GCB/ABC 二分法的 COO 层次结构，并对 DLBCL 的起始和发病机制产生了见解。

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DLBCL肿瘤微环境的组成和预后图谱

• With EcoTyper, we identified 39 TME cell states from 12 major immune and stromal lineages in DLBCL（对肿瘤微环境的细胞状态进行表征）。

• 数据分析表明 DLBCL TME 具有相当大的多样性，并强调了非恶性细胞塑造 DLBCL 临床轨迹的能力。

  
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Cellular composition and community structure of ABC and GCB DLBCL

• To systematically dissect the TME of ABC and GCB DLBCL, we next analyzed
  1.6k bulk tumors and scRNA-seq profiles of seven de novo DLBCL tumors for which COO labels were known

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De novo reconstruction of multicellular ecosystems in DLBCL

在展示了 DLBCL 亚型的community structure之后，接下来重复了我们对 COO 不可知的分析。 为此，采用了一种聚类程序，将细胞状态组装成最大化共关联模式的模块。 将这种方法应用于发现队列，EcoTyper 揭示了 DLBCL 中的**九个多细胞生态系统，我们将其称为淋巴瘤生态型 (LEs) **。

LE 的组成细胞状态数量差异很大，具有由 CellPhoneDB 预测的广泛的异型配体-受体相互作用，并且可通过临床、细胞和遗传特征进行区分。 此外，在超过 1,000 个独立的 DLBCL 肿瘤中可检测到 LE，强调了它们的稳健性。跨数据集，89%（9 个中的 8 个）的 LE 具有显着的预后意义，并且大多数在对先前定义的亚型进行多变量调整后仍保持预后，强调了它们的独特性。 此外，LE 在预测 OS 方面优于对大量肿瘤表达数据的直接 NMF 聚类，并且在包含现有分子亚型的逐步生存模型中优先选择。 LE 也很大程度上独立于最近描述的 DLBCL 中的四种 TME 亚型，并且在逐步生存模型中同样受到青睐。

为了便于解释，通过与结果的关联来组织和标记 LE。 在预后不良的 LE 中，LE 1、2 和 3 最为显著，并通过与 ABC DLBCL（LE1 和 LE2）和double-hit淋巴瘤（LE3）相关的细胞群落来区分。 相比之下，LE4-high 肿瘤富含 ABC，B 细胞耗尽，并以免疫反应性 T 细胞状态为特征，并广泛表达共抑制和刺激分子。 虽然 LE5 不具有预后意义，但其潜在的细胞状态在健康淋巴组织中更为普遍，反映了正常丰富的细胞population。 与此一致，LE5 的组成状态在空间转录组学分析的正常人类淋巴结标本中显示出空间共定位的证据，对于其他具有正常富集证据的 LE 也是如此。

在预后良好的 LE (LE6-LE9) 中，LE8 高的肿瘤独特富集 GCB 淋巴瘤及其相关基因型病变（EZB、ST2、C3 和双打击淋巴瘤）。 相比之下，LEs 6、7 和 9 通常独立于分子亚型，但在基质含量高的肿瘤中升高。 先前的研究已将基质细胞特征与 DLBCL 的卓越结果联系起来。 然而，这些特征的细胞组成尚不完全清楚。 通过 EcoTyper，将 Stromal-1 分解为不同的表型程序和 LE 类。 例如，发现 LAMA4 标记 LE7 中的肿瘤相关内皮细胞，而 POSTN 和 THBS2 标记 LE9 中的癌症相关成纤维细胞。 有趣的是，LE9 不仅富含成纤维细胞和其他 TME 元素，而且还高度预测更长的存活时间。 事实上，LE9 在预后意义方面优于 GC 样 B 细胞及其相关生态型 (LE8)

Collectively, these data reveal extensive multicellular community structure in DLBCL and provide a rich resource for hypothesis generation and future investigation.

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Prediction of therapeutic benefit with DLBCL EcoTyper（算法预测）

虽然已经描述了 DLBCL 患者的各种风险指数，包括international prognostic index、COO、遗传亚型等，但这些生物标志物目前不指导 DLBCL 诊断时的治疗选择。 鉴于 EcoTyper 能够量化外部数据集中预定义的细胞状态和细胞生态系统，接下来探索了它在随机临床试验中用于预测性生物标志物发现的效用。

Collectively, these results implicate CXCR5+ CD8 T cells in RB-CHOP efficacy and underscore the promise of EcoTyper for systematic identification of cell states and multicellular communities predictive of clinical outcomes.

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DISCUSSION

• 最为关键的一点，肿瘤细胞与其微环境的相互作用是研究的关键所在，单细胞空间的联合分析，可以从精度和空间位置上表征真正的肿瘤特征。

Methods（我们关注一下单细胞的部分）

Single-cell differentiation states

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Copy number analysis and B cell clonotypes（这个昨天分享过）

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生活很好，有你更好