使用HiCUP进行Hi-C数据预处理

2019-08-12 本文已影响40人生信修炼手册

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HiCUP是一款经典的Hi-C数据预处理软件，官网如下

https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/hicup/

数据处理的流程示意如下

首先通过hicup_truncater识别原始序列中的junction reads, 最典型的Hi-C的reads如下所示

R1和R2来自两个不同的fragments, 当然这取决于插入偏度长度和读长的关系，当连接点与fragment两端的距离小于测序读长是，会发生下图所示的情况

其中一端的序列是一个嵌合体序列，这样的序列在后续比对时会被过滤掉。为了保留这部分有效reads,hicup_truncater根据酶切位点的特征来识别所有reads上的连接位点，从而识别上图中的嵌合体序列，并对这样的序列末端进行切割，切除多余的嵌合体序列。切割完之后，这样的序列和普通的R1,R2就一样了，可以进行后续的mapping。

hicup_mapper将双端reads与参考基因组比对，由于Hi-C文库的R1和R2来源于空间结构近的染色质，其线性距离比传统的双端测序插入片段的长度大的多，如果直接进行双端比对，觉得部分reads都比对不上参考基因组，所以这里是对每一端的序列分别比对，然后再进行合并。

hicup_filter对比对上的序列进行过滤，如下图所示

只保留valid di-tags, 其他诸如selft-ligation, Re-ligation等片段都会被过滤掉。

hicup_deduplicator用来去除PCR重复，因为valid reads的多少用来表征染色质互作的频率，PCR重复的reads数量会对这个信息造成干扰，如果不去除PCR重复，junction reads的数目多可能是PCR重复多，不一定是因为染色质交互频率强而导致的reads多。

软件的安装也很方便，直接下载解压缩即可。使用步骤如下

1. 准备参考基因组的索引文件

所有的参考基因组比对软件都需要事先对基因组建立索引，HiCUP支持使用bowtie或bowtie2进行比对，以bowtie2为例，建立基因组索引的方式如下

bowite2-build hg19.fa hg19

第一个参数是基因组的fasta文件，第二个参数是输出的索引文件的名称。

2. 准备参考基因组酶切位点图谱

采用hicup_digester这个脚本来创建基因组的酶切图谱，基本用法如下

hicup_digester \
--re1 A^AGCTT,HindIII \
--genome hg19_digester_db \
hg19.fa

根据限制性内切酶识别的位点，将基因组序列进行模拟酶切，得到所有可能的酶切片段。--re1指定切割位点的序列和内切酶的名字，--genome指定输出文件的名称。最终输出的文件名示例如下

Digest_hg19_digester_db_HindIII_None_09-46-07_17-05-2019.txt

3. 编辑配置文件

首先通过如下命令生成一个配置文件的模板

hicup --example

该命令会生成一个名为hicup_example.conf的文件，在此基础上进行编辑就可以了。在配置中对每个选项都体用了详细的注释，根据需求修改即可。常用的修改的选项如下

#Path to the reference genome indices
#Remember to include the basename of the genome indices
Index: /bi/scratch/Genomes/Human/GRCh38/Homo_sapiens.GRCh38
#Path to the genome digest file produced by hicup_digester
Digest: /bi/scratch/Genomes/Human/GRCh38/Digest_Homo_sapiens_GRCh38_HindIII_None_14-43-31_10-02-2016.txt.gz
#FASTQ files to be analysed, placing paired files on adjacent lines
s_1_1_sequence.fastq.gz
s_1_2_sequence.fastq.gz

包括基因组索引和酶切图谱的路径，以及需要处理的Hi-C原始fastq文件的路径。

4. 运行

准备好配置文件之后，就可以运行了，用法如下

hicup --config hicup.conf

在输出结果的目录会生成一个html文件，展示了质控的各项指标，内容如下所示

1. Truncating and Mapping

2. Filtering

示意如下，可以看到valid pairs的比例在50%左右

3. Length Distribution

4. De-dupliation

除此之外，输出目录还有很多的文件，其中后缀为hicup_bam的文件包含了最终的de-duplication之后的reads的比对结果，可以用于下游的分析。

·end·

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