【文献分享】白菜叶片单细胞

今天分享另外一篇关于大白菜叶片单细胞的文章。

近日，中国农业科学院蔬菜花卉研究所在PBJ上发表了题为“Single-cell transcriptome reveals differentiation between adaxial and abaxial mesophyll cells in Brassica rapa”的论文。该研究通过对白菜叶片进行单细胞测序结合改良的tape-sandwich方法以及RNA原位杂交，区分了叶片栅栏组织和海绵组织，并鉴定了它们在单细胞水平的差异，揭示了腹面叶肉细胞和背面叶肉细胞的分化（但是这个文章只有2-3页，不确定是什么类型的文章）。

样品选择：young leaves of Chinese cabbage at the rosette stage（莲座期大白菜的幼叶，下图a）

单细胞测序结果：共获得16,055个细胞和30,124个基因（但是作者做了3个重复，应该是重复加起来的结果）。下图b是三个重复的UMAP结果。

然后作者做了和RNA-seq之间的相关性，从下图c中可以看出相关系数0.74说明相关性比较好。

利用获得的16055个细胞，接下来就是常规的聚类分析，可以分成17个cluster（下图d）。下面就是比较复杂和繁琐的细胞类型注释，作者采用的依然是利用arabidopsis已知的marker基因：MC(PNSL1,LHCB2,CRR23,RBCS3B)，EC(DCR,FDH,PDF1,ATML1)，GC（MYB60,ALMT12,FAMA），BS(MYB28), VC(WOX4,MP,PXY,SMXL5), Phloem（APL,SEOR2,PP2A-1,SUC2）,xylem(XCP2,TMO5),PC(HIS4,TSO2,CTCA1;1,CDKB2;1)（下图e），把17个cluster分为了8种细胞类型即叶肉细胞、表皮细胞、维管细胞、维管束鞘、保卫细胞、增殖细胞、韧皮部和木质部，和剩下的unknown（下图d）。

然后作者为了衡量结果的准确性，和拟南芥的叶片单细胞数据进行了对比，进一步确认了注释的准确性（下图f，g，h）。

从UMAP聚类结果来看，作者并没有把MC叶肉细胞细分，所以作者接着进一步采用改良的tape-sandwich方法分离了叶片栅栏组织和海绵组织（上图i），通过转录组分析去鉴定一批新的标记基因，从而将腹面的栅栏细胞和背面的海绵细胞在单细胞水平上区分开来。利用腹面和背面的已知marker基因可以看出，这些marker基因在栅栏组织和海绵组织中都有明显的富集（上图j）。通过转录组，鉴定了两种细胞类型之间明显差异的6731个基因。结合拟南芥的差异基因鉴定结果，最终筛选了433和510个PMC和SMC的marker基因。

为了更好的解析叶肉细胞，把叶肉细胞单独拿出来聚类，聚成了9类（M0-M8）（上图k）。然后利用重要的marker PMC（LHCB4.3,LHCA6,Bra018819）（上图l，m，p）和 SMC（BrFIL.1，BrYAB3， BrYAB5）（上图l，n，p）以及利用转录组鉴定到top100个marker基因，可以把这9类分为PMC（M0，M2）,SMC（其它cluster）（但是我看图m，n总感觉有点牵强）。BrFIL.1的原位杂交分析也确认了关于SMC和PMC的定义（上图o，p）。PMC和SMC的富集分析表明，栅栏细胞除了行使光合作用外，还有很多核糖体相关的蛋白（上图q，r）。并且蛋白互作分析表明互作度最高的top10的基因都是核糖体相关的（上图s）。而海绵细胞主要响应外部环境刺激，例如温度，JA，SA等（上图t，u）。

此外，利用RNA-seq数据，该团队发现大多数已知的背腹极性基因在成熟叶片中几乎不表达，而是在叶片发育的起始或早期阶段特异性表达（下图b）。这可能也是一些已知的marker基因在单细胞数据里面没体现的重要原因。

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