RNA甲基化修饰m6A检测热门技术—MeRIP-seq

m6A甲基化是转录后调控中重要的表观遗传修饰方式，它普遍存在于病毒和真核生物中。MeRIP-seq（高通量测序法）作为m6A修饰的检测方法，其具有针对全基因组范围内检测m6A的存在；能够明确每个基因的修饰水平，进行组与组之间比较等优势。接下来就让小编带大家详细了解m6A和MeRIP-seq。

1.在介绍m6A之前，首先认识一下什么是转录后调控？

转录后调控(post-transcriptional control)是指在转录后水平(RNA)上对基因表达的调控，包括对真核生物基因的转录产物进行的一系列修饰和加工。

转录后调控具体主要体现在：

1）对mRNA前体hnRNA的剪接和加工；例如5’-端加帽、3’-端polyA尾、RNA修饰、RNA剪接。

2）mRNA由细胞核转至细胞质的过程及定位；

3）mRNA的稳定性、降解、翻译过程等多个环节进行的调控；

4）RNA编辑和RNA干扰等现象也属于转录后调控。

2.什么是m6A？

m6A甲基化修饰是指腺嘌呤的6号碳原子连接的氨基基团中的一个氢被甲基基团取代，在m6A甲基化过程中涉及的这3类重要的酶：

①Writers，甲基化酶，催化m6A甲基化的发生；

②Erasers，去甲基化酶：去除m6A甲基化的修饰；

③Readers，m6A识别蛋白，识别m6A修饰位点。

如下图所示，m6A是动态可逆的。

Dominissini, D. et al.（2014）

3. m6A具有哪些生物学功能，以及应用的领域？

m6A具有调控可变剪切、调控mRNA出核转运、调控mRNA的选择性翻译和翻译速率、相分离以及与RNA的稳定性有关等功能。

m6A作为最常见的一种转录后修饰，介导了超过80%的RNA甲基化。其调控机制与生物学功能涉及各个领域：

医学：

1）癌症：肺癌、肝癌、等，研究的主要内容包括m6A修饰如何影响肿瘤的发生、增殖、转移、耐药等；

2）其它类疾病：心血管疾病，神经性疾病，代谢类疾病等；

3）胚胎发育等。

农学：

研究的物种有果蝇，斑马鱼，猪；拟南芥、玉米，水稻，番茄等。

4. MeRIP-seq的实验设计？

实验样本：

细胞、组织、提取后的总 RNA（限定有参基因组物种）。

实验分组：

细胞模型：实验组VS对照组，建议3:3

组织模型：正常组VS疾病组，建议5:5

组内对照：IP组VS input组*

注*：input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合，是必备的组分

测序平台：NovaSeq

关键分析内容：

m6A的基本特征

特征一. Peak在基因元件的分布

特征二. reads在基因元件的分布

特征三. Peak关联基因的特征

5. MeRIP-seq的送样要求？

• 样本类型：细胞、组织、total RNA

• 样本要求：

➢人、大鼠、小鼠

常规MeRIP-seq：Dnase消化后RNA总量≥25μg，浓度≥100 ng/μg，RIN≥8；

➢非人非鼠物种

Dnase消化后RNA总量≥150μg，浓度≥100 ng/μg，RIN≥8。

注：

1）人、小鼠和大鼠可同时检测mRNA和lncRNA上的m6A修饰，非人非鼠物种（人、小鼠、大鼠以外的物种）只能检测mRNA上的m6A修饰；

2）尽量提供RNA样本；

3）如需公司进行RNA提取，请根据样本特性估算样本量，最终获得的RNA质量和总量以质检结果为准；

4）活体取样，剔除结缔组织以及其它非研究组织，用预冷的PBS漂洗，去除血液和杂质。体积较大的组织需切割成绿豆大小的小块。将组织放入事先标记好样本信息的RNAase-free管中（管子速冻后无法做标记），立即液氮速冻2min，-80℃保存。

6. MeRIP-seq建库测序流程？

MeRIP-seq技术包括MeRIP实验和测序两个部分。

流程图如下图所示：

每组MeRIP-seq由两种类型的样本组成，即immunoprecipitation（IP）样本和Input对照样本。RNA分子首先被片段化成约100-200nt的片段。通过抗m6A的特异性抗体，IP样本提供了甲基化RNA片段的无偏测量。同时，Input对照样本可反映基础RNA的丰度。通过建库、高通量测序和生物信息学分析，给出全转录组m6A的定位。

Fu, Y et al. (2014)

7. MeRIP-seq分析流程？

测序数据下机之后，我们就可以获得原始测序序列(Sequenced Reads)，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，我们通过如下标准流程进行生物信息分析：

8. MeRIP-seq后续的实验验证？

MeRIP-qPCR：利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后，下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。建议结合基因表达RT-qPCR 、WB等验证手段一起进行试验结果验证。

9. m6A甲基化的研究思路？

典型的m6A研究的法则：

1）m6A测序前的预实验，检测RNA的m6A水平是否发生差异等；

2）m6A测序及转录组学挖掘差异基因；

3） 后期功能验证。

10. 相比其他m6A检测方法，MeRIP-seq具有哪些优势？

1、针对全基因组范围内检测m6A的存在；

2、m6A的检测结果检测到基因水平；

3、能够明确每个基因的修饰水平，进行组与组之间比较；

4、检测平台为测序仪，仪器限制低，通用性高，重复性好；

5、结果可以和其他组学联合分析，从多维度讲述机制机理故事；

6、实验操作简单，入门容易。