【文献分享】病原菌如何逃避植物免疫过程
写在前面
分享一篇由南京农大王源超老师和图宾根大学的Thorsten 教授近期发表在nature microbiology上的review "Evasion of plant immunity by microbial pathogens "，主要概述了病原菌的效应子介导的逃避植物免疫的过程，对于我们认识效应子的功能及整体的植物免疫过程有重要的意义。
Introduction
植物是否感病是由宿主、病原菌和环境共同决定的。植物的免疫系统可以分为三个层次:免疫识别、信号传导和实施防卫。而为了破坏植物的防卫反应，病原菌会采用以下几种策略。如移去免疫激发子上的修饰以便不激活植物免疫；另一种策略是分泌效应子到宿主细胞内，破坏植物免疫过程来达到侵染的目的。
1.The plant immune system
PTI是植物的基础防卫反应，对不适应宿主的病原菌展示出完全抗性，对适应宿主的病原菌展示出部分抗性。
病原菌通过分泌效应子来躲避植物的PTI反应，而植物会进化出NLRs类蛋白，来直接识别或者识别效应子造成的宿主蛋白的修饰来发挥防卫反应。
NLRs根据N端结构域的不同分为CNL，TNL和RNL。把能够感知病原菌(直接或间接)的称为sensor NLRs，而有一类NLR通常在sensor NLR下游发挥作用，起放大防卫反应的作用，称为helper NLRs，如拟南芥里面的NRG1和ADR1。sensor NLRs 和helper NLRs(NRG1)能够在膜上形成寡聚复合物，形成钙离子通道来激活ETI和细胞死亡。PTI和ETI并不是独立的，而是可以相互促进的。
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2. Evasion of plant immune recognition
2.1 Evasion of PRR- mediated detection
激发植物防卫反应最经典的激发子是细菌的flg22和真菌的chitin，分别被FLS2和含lys-motif受体识别。
从MAMPs的角度
为了躲避植物的防卫反应，细菌方面，Ralstonia solanacearum中flg22发生突变，因此不能被FLS2识别；Pseudomonas syringae中，AlgU下调了侵染过程中鞭毛蛋白的表达，也就减少了flg22的产生；P. syringae分泌碱性蛋白酶ArpA来降解鞭毛蛋白。植物分泌BGAL1靶向鞭毛蛋白的O糖表位来释放flg22；细菌通过改变鞭毛蛋白的糖基化水平或产生BGAl1的抑制剂来减少flg22的产生。
真菌为了躲避植物的防卫反应，通常会分泌一些结合chitin的效应子。如Cladosporium fulvum中，Avr4，保护真菌细胞壁免受植物几丁质酶降解；C. fulvum，Ecp6，包含lysin motif，通过直接结合chitin隔绝chitin寡聚物的释放，干扰植物对几丁质的识别。真菌也会分泌具有几丁质酶活性的效应子将几丁质寡聚物更小的片段【chitinase- like effectors (EWCAs)】或分泌多糖的去乙酰化酶来将几丁质的寡聚物上的乙酰化残基给去除，变成壳聚糖【Verticillium dahliae and F. oxysporum中，多糖去乙酰化酶PDA1】，来减少激活的植物防卫反应。
从调节PRR的角度
P. syringae分泌type III effectors(T3Es)来抑制PRR的丰度。HopU1编码单ADP核糖基转移酶通过破坏GRP7(一类RNA结合蛋白)和FLS2的转录本的联系来减少FLS2的积累；AvrPtoB拥有E3连接酶的活性来靶向降解PRR，如FLS2；HopAO1编码酪氨酸磷酸酶，通过靶向FLS2的激酶域来阻止FLS2酪氨酸位点的磷酸化来抑制植物免疫。
F2 Microbial pathogens possess multiple mechanisms to evade plant PRR-mediated recognition.png
2.2 Evasion of NLR-mediated detection
NLR是监测胞内效应子的主要守卫。宿主适应性的效应子通过修改AVR基因(如删除，序列多样性或转录多样性)、获得上位性的效应子、调整guardees或decoys来破坏ETI。
基因组学的研究发现，一些效应子定位在高度可变的、富含重复区的位置，这有利于其快速进化。Phytophthora infestans上发现，效应子主要定位在基因稀少或染色体富含重复区的地方，展示出高比例的多样化选择。Leptosphaeria maculans中，效应子存在于A+T等容线，由转座子点缀着，这也就驱动着AVR的获得、丢失或等位变异。
对于特定的AVR来说，基因组上的完全丢失占据了分子进化过程中的重要一部分。群体遗传研究发现，L. maculans中，能侵染携带抗性基因RLM1 90%的小种都缺失了AvrRLM1位点。AVR可能包含移码突变或转座子插入，从而导致翻译的提前终止。在AVR- Pita的编码区插入Pot3转座子改变了稻瘟病菌的侵染表型。在L. maculans，AvrLm6这个位点通过点突变产生了多个提前终止的密码子，导致了RLM6介导的抗性丢失。
此外，AVR还通过积累错义突变来逃避NLR的识别。例如，在Hyaloperonospora arabidopsidis中，效应子ATR1的一个点突变，刚好在在ATR1和RPP1互作界面上，也就减少了ATR1和RPP1的互作，因此逃避了RPP1的识别；另一个例子，H. arabidopsidis效应子RxL103在核定位信号上有突变，使其在细胞核内积累减少，因此逃避了RPP4的识别。Phytophthora sojae效应子Avr3c，将174位Ser替换为Gly，减少了其对宿主靶蛋白-富含Ser/Lys/Arg蛋白-的亲和力，导致了逃脱Rps3c介导的免疫。在某些方面，大量替换区分了识别和非识别的变体。例如，P. infestans效应子AVR2靶向宿主磷酸酶BSL1，被马铃薯的免疫受体R2所识别；P. infestans的变体--AVR2-like，在成熟蛋白中有13个氨基酸的多态性，逃避了马铃薯中R2的识别。尽管AVR2-like也结合BSL1，但这对复合物不能被R2所识别，因此逃避了R2介导的免疫识别。
病原菌通过改变AVR基因的表达来阻止ETI的激活。例如，H. arabidopsidis中缺失RxL103逃避了RPP4介导的免疫；在稻瘟病菌效应子AVR- Pita1，promoter上插入了一个转座子，因此阻止了基因的表达，使该小种变成有毒小种；P. sojae中Avr3a/5，由于promoter上的重排(插入或缺失)或小RNA的积累导致了Avr3a/5不表达；AVR基因的表达也受表观调控，P. sojae毒性小种中组蛋白H3的甲基化增加，减少了Avr1b的表达。
另一种逃避ETI的策略是获得上位性的效应子来结合或调节NLRs和AVRs。P. syringae 中HopZ3(T3E)编码乙酰转移酶，HopZ3结合到AvrB3–RPM1免疫受体复合物上，乙酰化AvrB3上对免疫激活重要的残基；Xanthomonas oryzae TAL(transcription activator-like)效应子在保守氨基酸或C端产生变体，从而干扰了xa1介导的免疫。IPI-O在P. infestans中是多家族的，类型1和3的变体，如IPI-O1，激活了马铃薯中Rpi-blb1依赖的免疫；类型3的变体，如IPI-O4，逃避了Rpi-blb1的识别；IPI-O4与Rpi-blb1互作，并且阻止了其激活，可能通过破坏了Rpi-blb1的寡聚化。
许多NLR通过间接检测潜在的AVRs的靶点来识别AVRs，靶点通常被称为守卫或诱饵。经典的例子是拟南芥的膜蛋白RIN4，RIN4被多个AVR所识别，包括AvrB, AvrRpm1, AvrRpt2 and AvrB3，同时也被不同的NLRs(RPS2 and RPM1)所守卫。P. syringae的AvrRpt2是一个木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶，能够切割RIN4，从而激活由RPS2介导的免疫反应。然而，单ADP核糖基转移酶HopF2抑制了Rpt2切割RIN4来阻断NLR的识别。相似的是，RIN4被两个不相干的T3Es(AvrB和AvrRpm1)磷酸化，激活了Rpm1介导的抗性。AvrRpt2切割RIN4阻断了RPM1的免疫激活。AvrRpt2的出现减弱了RPM1介导的免疫。HopZ3通过乙酰化RIN4和干扰RIN4的磷酸化来抑制了RPM1介导的抗性。
F3.Microbial evasion of host NLR receptor-mediated recognition-1.png
F3.Microbial evasion of host NLR receptor-mediated recognition-2.png
3. Modulation of plant immune signalling
通过免疫受体检测病原菌的侵染从而启动动态且关连的信号网络。对该信号网络进行紧密调控是起始免疫反应的先决条件 。正因如此，病原菌已经进化出策略来损害宿主稳健的防卫信号网络。
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3.1 Subversion of immune signalling components
一些效应子会靶向PTI的中心信号成分，如BAK1,BIK1和MAPKs。BAK1作为多个PRR的共受体，会被多个细菌效应子所靶向，如AvrPto, AvrPtoB, HopF2 和 HopB1。AvrPto和AvrPtoB通过阻断BAK1和其共受体形成PRR复合物来抑制免疫反应，HopB1结构性的与FLS2联系，从而切断了与BAK1的联系。当感知到配体后，BIK1快速磷酸化和单泛素化，快速从PRR复合物中释放，从而激活免疫反应。Xanthomonas campestris 的T3E AvrAC 尿苷酰化BIK1保守的磷酸化位点，从而阻断它的磷酸化和随后的免疫响应。P. syringae T3E AvrPphB，一类半胱氨酸蛋白酶，通过切割BIK1和其他PBL类激酶来抑制PTI。R. solanacearum 的T3E RipAC 通过抑制E3连接酶 PUB4来让BIK1不稳定，从而破坏了BIK的稳态来抑制免疫反应。此外，真菌的效应子NIS1同时阻断了BIK1和BAK1的激酶活性来破坏PTI。
效应子也会靶向ETI的相关蛋白。R. solanacearum T3E RipAC 靶向G2 allele of skp1 (SGT)的抑制子，SGT通常来调节NLR的积累。RipAC与SGT1互作，阻断了它被MAPKs所磷酸化，导致了减弱的依赖SGT1的ETI响应。Heat shock chaperone 90 (HSP90),SGT1的分子伴侣，对于多种成熟后的NLRs是必需的。P. syringae T3E HopBF1 模拟HSP90的底物，通过磷酸化让HSP90失活。脂酶类蛋白EDS1在PTI和ETI都发挥重要作用，EDS1分别与PAD4或SAG101形成异源二聚体复合物来激活植物免疫反应。Phytophthora capsici RXLR效应子Avh103通过联系EDS1的脂酶结构域来抑制EDS1与PAD4复合物的形成来抑制免疫反应。另一类与 效应子靶向的ETI 相关蛋白的目标包括 hNLR，它是许多sensor NLR 完全激活所必需的。NRC2和NRC3这类helper对于番茄Prf介导的免疫是重要的，而NRC4调节马铃薯Rpi-blb2介导的抗性。这三个NRCs冗余地调节多个CNLs地激活，包括Rx, Bs2,R8 and Sw5b等。P. infestans效应子AVRcap1b 和线虫效应子SS15 靶向NRC2和NRC3，因此阻断了sensor NLRs到hNLRs的传递。
MAPK cascade在早期的PTI和ETI反应中都有重要作用。P. syringae T3Es HopA1和HopF2，破坏由flg22激活的免疫反应，HopA1是一个磷酸苏氨酸裂解酶，通过去磷酸化来失活MAPK3/6，而HopF2通过ADP的核糖基化来失活MAKK5。P. syringae T3Es AvrB 诱导了负调激酶MAPK4的激活，来重编程植物激素信号。P. infestans RXLR效应子PexRD2与MAP3K互作，促进侵染烟草。
3.2 Reprogramming the host transcriptome
病原菌通常会进化出各种策略来改变宿主的转录响应，包括分泌转录因子或转录抑制子，干扰宿主转录因子，表观调控或调节mRNA的剪接。Xanthomonas和Ralstonia TAL类转录因子通常作为一种毒性因子来激活一些感病基因的表达，包括sugar transporter-encoding SWEET基因；转录抑制的例子包括稻瘟病菌的效应子HTR1和HTR2，来重编程宿主的转录。P. sojae效应子CRN108靶向HSPs的启动子区，阻断了宿主转录因子HsfA1a对它的结合，因此阻断了HSP基因的转录。病原菌也会靶向宿主的转录调节元件来改变基因表达，例如，X. campestris pv. vesicatoria的T3E XopD 通过隔绝MYB30入核发挥功能，达到侵染的目的。另一个重要的靶点是NPR1，这是防卫基因的转录共激活子，被防卫激素水杨酸所调节，有SA时，P. syringae T3E AvrPtoB 泛素化NPR1，因此破坏了依赖SA的防卫信号；P. capsici 效应子RxLR48 通过促进NPR1的核定位来促进侵染。
表观调控也在植物和微生物互作中发挥重要作用。例如，OsWRKY72通过诱导JA合成基因AOS1启动子区高度甲基化来下调JA信号通路，这一过程被Xoo所利用来完成侵染。在某些方面，病原菌分泌效应子来操控宿主的表观过程，如，P. sojae RXLR效应子Avh52结合和促进大豆乙酰转移酶TAP1的核定位。核定位的TAP1乙酰化组蛋白H2A和H3，导致了促进植物感病的基因高表达。P. sojae Avh23是另一个RXLR效应子来调节宿主的表达，通过结合乙酰转移酶SAGA的亚基来阻断其功能性伙伴GCN5的联系，Avh23因此调节了组蛋白H3 9th lys的乙酰化水平，导致了侵染过程的转录重编程。
可变剪接是一个重要的增加转录本多样性的转录后修饰过程。转录组揭示在役霉菌侵染马铃薯后，有超过5000个基因展示出可变剪接。并且役霉菌选择性地调节防卫基因和感病基因的可变剪接来完成侵染。役霉菌的一些RXLR效应子抑制马铃薯基因的可变剪接。例如，SRE3(splicing regulatory effector 3)结合到剪接因子U170K上。役霉菌效应子Avr3c通过结合和稳定剪接复合物来调控一系列基因的表达。T3E HopU1靶向RNA结合蛋白GRP7，GRP7被认为是调控拟南芥对丁香假单胞菌的抗性。
3.3 Rewiring host phytohormone signalling
双子叶植物中，SA对活体营养型病原菌有抗性，JA和ET对死体营养型病菌有抗性；在单子叶植物中，SA，JA和ET在不同生育期发挥作用。病原菌可以通过破坏激素的产生及其信号通路来阻止植物免疫的激活。一个典型的例子是冠菌素，由多种丁香假单胞菌分泌的毒素，它通过模拟JA的类似物 JA-ILE来破坏植物的免疫。冠菌素直接结合JA的受体来激活JA信号，冠菌素利用JA和SA途径的拮抗作用来帮助病原菌达到侵染的目的。另一个例子是操纵植物激素的产生，干扰激素的感知和信号通路等。例如，瘤黑粉菌、大力轮枝菌和役霉菌分别通过使用分支酸变位酶效应子Cmu1和易解酶效应子VdIsc1和PsIsc1来降解SA的前体，从而减弱SA的合成和信号途径。番茄双生病毒的C4蛋白从质膜到叶绿体重定向，通过与叶绿体的CAS(calcium sensing receptor)互作来干扰SA的合成。役霉菌的效应子Avh238去稳定ACS(1aminocyclopropane-1-carboxylate synthase)来阻断ET的合成。稻瘟病菌使用分泌的单加氧酶Abm来羟化JA来减弱JA信号通路。棉花病菌中的βC1蛋白通过干扰SCF复合体来降解JA的受体COI1。丁香假单胞菌 T3E HopX1 切割JA的转录抑制子-JAZ蛋白，来激活JA途径、抑制SA途径来完成侵染。一些病原菌也会产生毒性因子来干扰auxin途径，例如，AvrRpt2通过增加植物auxin水平来对抗防卫反应。
4. Disarming plant immune outputs
植物的免疫防卫反应包括：细胞壁加厚、蛋白酶或抑制剂的分泌、抗菌物质的释放、小RNA的产生、微生物群的调控。病原菌会逃过这些过程来完成侵染。
4.1 Cell wall modification
植物细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶、木质素、角质和木栓质构成。病原菌的入侵会使细胞壁加厚，如胼胝质和木质素的沉积，来限制病原菌摄取养分。瘤黑粉菌的效应子Tin2通过重定向，操纵木质素合成花色素苷来发挥作用，Tin2稳定了激酶TTK1，来促进了花色素苷的积累，破坏了木质素的合成；木质素的减少破坏了细胞壁的通透性，从而促进了真菌的营养获取。
效应子除了靶向维护宿主细胞壁的蛋白外，病原菌也分泌一些细胞壁降解酶来直接破坏细胞壁，包括角质酶，果胶酶，纤维素酶，半纤维素酶，木质素修改酶。役霉菌中结合铜的多加氧酶效应子通过切割果胶来发挥作用；马铃薯病菌中效应子Avr42结合去乙酰化的果胶，阻断了钙离子介导的细胞壁间的交联，Avr42和真菌的多聚半乳糖醛酸酶协同发挥作用来破坏细胞壁的完整性。
植物也进化出一系列酶的抑制剂来抵消效应子的作用。XEG1&GIP1.
植物也进化出策略来保持细胞壁和膜的完整性。役霉菌RXLR效应子，IPI-O1，破坏质膜之间的联系，从而帮助侵染。
4.2 Interference with plant hydrolytic enzymes
植物质外体环境包含大量的蛋白酶，来帮助植物抵抗病原菌的侵染。例如，番茄的PLCP(papain like cysteine protease) Rcr3作为诱饵，介导了PRR Cf-2的激活。最近的研究发现，Rcr3被番茄枯草杆菌类蛋白酶激活，如P69B。
作为抵抗，病原菌通过阻止分泌，结合和激活质外体蛋白酶来躲避抗性。例如，役霉菌的效应子AVRblb2和丁香假单胞菌的效应子Avh240分别靶向宿主PLCP C14和天冬氨酸蛋白酶AP1来阻止其分泌到质外体中。丁香假单胞效应子Avh181靶向SNAP受体复合物(SNAP被认为在囊泡运输发挥作用)，还能抑制GIP1和P69B的分泌。病原菌也会分泌抑制剂来破坏宿主蛋白酶。例如，病原菌分泌Kazal类蛋白酶抑制剂，包括EPI1，来抑制P69B，并且阻断Rcr3和PC2的成熟。Pit2，由瘤黑粉病菌分泌，是玉米PLCPs的模拟底物，干扰了PLCPs调控的免疫。
效应子的翻译后修饰，如糖基化，被认为用来促进侵染。例如，役霉菌产生糖基化和非糖基化的毒性效应子XEG1，宿主的天冬氨酸蛋白酶AP5降解了非糖基化的XEG1，并且展示出对糖基化形式的低亲和力。糖基化对于XEG1发挥功能很重要，揭示了N-糖基化对于效应子成功逃避植物的免疫特别重要。
4.3 Detoxifying antimicrobial molecules
病原菌会进化出解毒或耐受杀菌化合物的能力。例如，α-番茄素，番茄中主要的糖生物碱，对多种真菌病原物是有害的。番茄的病原物会分泌番茄素酶来将α-番茄素来转换成毒性较低的衍生物。玉米中，分泌的DUF26家族蛋白AFP1结合甘露糖，对瘤黑粉病展示出抗性。然而，瘤黑粉菌会产生包含重复的效应子，Rsp3，结合AFP1，保护菌丝免受化合物的攻击。
活性氧会在植物受到攻击时快速产生，导致氧化压力。病菌会进化出多种措施来逃避宿主的氧化压力。例如，细菌会产生胞外多糖，形成保护层来阻断氧化压力；瘤黑粉菌中，可变剪接产生核心的过氧化物酶-GAPDH-来帮助病原菌耐受氧化压力。为了回应氧化压力，白叶枯菌的鞭毛蛋白基因fliC，RNA编辑 由A变成I，氨基酸从Ser变成Pro，造成了纤丝结构的改变和细菌生物膜的形成，增加了细菌对氧化压力的耐受性。
病原菌也会分泌效应子来阻断宿主ROS的产生、促进ROS清除。植物中，ROS的产生依赖过氧化物酶体和质膜定位的NADPH氧化酶。瘤黑粉菌中的效应子Pep1通过直接抑制过氧化物酶PXO12来减少ROS产生；稻瘟病的效应子 AVR-Pii抑制NADP-malicenzyme2 来阻断NADPH的产生，从而抑制了NADPH氧化酶的活性；役霉菌nudix 效应子AVr3b编码ADP-核糖-NADH-焦磷酸化酶，通过干扰NADH可获得性来减少ROS积累；白叶枯菌的T3E AvrRxo1通过直接磷酸化 NAD来抑制ROS产生。役霉菌的效应子CRN78通过磷酸化和降解水通道蛋白PIP2来抑制ROS积累。细菌感知到氧化压力后通常会释放抗氧化的酶，如过氧化氢酶，过氧化物酶，超氧化物歧化酶来消除ROS。小麦白粉菌分泌胞外过氧化氢酶CatB来中和ROS，役霉菌效应子CRN115通过干扰过氧化氢酶来 抑制ROS积累。
4.4 Harnessing host RNA silencing
RNA沉默是由小RNA介导的主要防卫机制，直接靶向特定序列的基因来降解或翻译抑制。在植物RNA沉默过程中，双链小RNA和发夹RNA被Dicer类蛋白加工成小RNA，小RNA被装进AGO，形成RISC复合物，沉默相应靶基因。miRNA和siRNA是植物内两种主要的小RNA，来调控防卫反应中的基因表达。在抗病毒过程中，RNAi早有报道，最近报道RNAi在植物抗细菌和丝状真菌也发挥作用。例如，大力轮枝菌侵染棉花，诱导了miR166和miR159的产生，miRNA被传递到大力轮枝菌，诱导了跨界的毒性基因的沉默；拟南芥分泌胞外囊泡传递小RNA到灰霉菌来沉默毒性基因。
病原菌也会来抑制RNAi的防卫反应。例如，役霉菌的RXLR效应子，PSR1，通过抑制植物内源siRNA的合成来干扰siRNA介导的转基因沉默。番茄萎黄病的沉默抑制子P22保护双链RNA不被DCL切割，而马铃薯病毒蛋白P25通过蛋白酶体途径促进了AGO1的降解。此外，一些沉默抑制子，P19，结合小RNA，阻止了RISC的形成。另一个例子中，双生病毒中的V3蛋白通过干扰钙调蛋白CaM3和CAMTA3的联系来破坏宿主的RNAi机制。一些病原菌也会靶向宿主蛋白来破坏RNAi机制，例如，灰霉菌传递小RNA到植物细胞中，结合AGO1，并沉默防卫相关的基因。
Modulation of the plant microbiota
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