系列笔记基于达澈生物讲座视频，从中初步学习了解生信分析中常遇到的组学分析技术。
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1、背景

1.1、RNA的特征

简略介绍下RNA的相关知识，感兴趣可深入查阅教材、文献等

• RNA有着多种多样的功能，可在遗传编码、翻译、调控、基因表达等过程中发挥作用；通常由DNA经由转录生成。
• 其中，mRNA（信使RNA）为遗传讯息的传递者，它能够指导蛋白质的合成。

中心法则

• 因为mRNA有编码蛋白质的能力，它又被称为编码RNA。而其他没有编码蛋白质能力的RNA则被称为非编码RNA（ncRNA），主要包括tRNA与rRNA
• 相比DNA，RNA最大的区别有：单链，较短，由于存在互补序列通过折叠形成双链接构。

image from wiki

• RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs) 对RNA功能具有重要作用，例如RNA运输、可变剪切，翻译等等；具体可以见wiki的介绍

  
  image from wiki

• RNA修饰(RNA modification)是指对RNA核糖核酸化学结构的改变（通常是接了一些基团），可能会改变其功能或稳定性。
  以下图m7G为例就是指在RNA鸟嘌呤(G)的第七位N上加上甲基的甲基化修饰

  
  common RNA modification

1.2、CLIP、RIP-seq

• CLIP、RIP-seq两种技术，我觉得就可以简单理解为RNA版本的ChIP-seq

  
  encode
• 即主要研究特定RNA binding protein（RBP）在RNA上的分布以及RNA特定修饰的情况。从而达到以下目的--
  （1）验证RNA与靶蛋白的直接相互作用及精确的结合位点；
  （2）在全基因组范围内鉴定RNA与RBP的相互作用网络；
  （3）lncRNA/circleRNA功能机制研究以及miRNA靶标鉴定。

也可以检测出RNA间的相互作用（例如lncRNA与miRNA）

• 下面就简单了解下这两种技术。

2、Clip-seq

• ultraviolet cross-linking and immunoprecipitation 紫外交联，免疫沉淀（2003年）
• 特征之一就是使用紫外交联方式，RNA与附着的蛋白（RBP）以共价键形式绑在一起，用于研究RNA结合蛋白在体内与众多RNA靶标（片段）的结合模式。

实验步骤

参考下图

• 1~2：紫外照射，使RNA与蛋白之间形成共价结合；然后降解RNA非蛋白结合区域；
• 3：使用RBP对应的特异性抗体，捕捉目标蛋白RNA复合物
• 4~5：RNA两端修饰
• 6~9：富集、纯化、去蛋白，再修饰、纯化
• 10~11：反转录、加接头，PCR建库
• 12：测序

image from 达澈生物 clip with RNA modification

升级过程

自2003年提出clip方法以来，出现很多改进的版本

（1）iclip 2010年

• individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation；
  能够以单碱基的分辨率，来展示RNA-蛋白互作的详细信息
• 关键技术在于中间的 cDNA环化

（2）eclip 2015年

• enhanced clip
  相比clip-seq，RBPs靶标识别率提高了2-3倍
• 不同之处主要体现在RNA文库制备步骤
  在免疫沉淀的磁珠上添加一个3'RNA接头用于和RNA片段交联；并且添加一个3'单链DNA接头用于反转录之后交联

（3）hiclip 2017年

• hybrid and individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation；
  在全转录组水平上鉴定与RBP结合的特定RNA复合体的方法
• 特征之一：若rbp同时结合两个rna链，均可以捕获出来；
  通过连接酶将双链RNA的两端壁进行连接

2、RIP-seq

• RNA immunoprecipitation sequencing
• 通过免疫沉淀目标蛋白来捕获蛋白体内结合的RNA（基本类似chip-seq）
• 即主要利用能够特异识别某一RBP或者某一RNA修饰的抗体；

实验步骤（以m6A-MeRIP-seq为例）

参考下图

• 首先提取total RNA，将RNA片段化（100nt左右）
• 使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化修饰的RNA片段进行富集；
• 然后纯化富集到的RNA片段；
• 最后上机测序。

image from wiki RIP with RBPs

关于RIP与clip-seq的比较

image.png

3、数据分析

• 基本流程分析还是类似于chip-seq；
• 数据质控→ 找peak → peak 分析；
• 新的研究思路还是需要阅读相关文献。

image from 达澈生物 image from 达澈生物

最后推荐一个研究RNA结构的必备网站：ENCORI，里面有很多公共clip-seq数据等