单细胞108篇文献解读之12---Promotion of ch
利用单细胞转录组研究发现促进胆管癌生长的癌症相关成纤维细胞亚群
图片
研究背景
在肝癌中，癌症相关成纤维细胞(CAF)的特性还有许多没有被研究明确。
本文研究了CAF在肝内胆管癌(ICC)中的功能作用，通过遗传谱系追踪、单细胞RNA测序和配体-受体分析发现肝星状细胞(HSC)是CAF的主要来源，而HSC来源的CAF是与肿瘤细胞相互作用的主要亚群。单细胞RNA测序将CAF分为炎性和生长因子富集(iCAF)和肌成纤维细胞(myCAF)亚群等，它们具有独特的配体-受体相互作用。
方法流程
图片
研究结果
1. 肝星状细胞来源的CAF是ICC中主要与肿瘤作用的亚群
小鼠肝内过表达致癌驱动子KRASG12D组合p19 CRISPR(KRAS/p19)，或myr-AKT组合YAPS127A(YAP/AKT)、NICD1(NICD/AKT)亦或FBXW7∆f(FBXW7∆f/AKT)，可产生组织病理学证实的细胞角蛋白7和19阳性ICC。利用TdTom标记HSC，发现在四个ICC的模型中，85％–95％Col1a1-GFP+CAF和85％–93%aSMA+CAF被标记，表明了CAF的HSC来源。scRNA-seq证实，在四个鼠ICC样本中91.9%±2.8%的泛CAF表达HSC的基因标记，并发现，在肿瘤微环境(TME)中HSC分化为更高活化水平的HSC-CAF。为确定HSC-CAF影响ICC的机制，通过CellPhoneDB分析了配体-受体相互作用：在鼠scRNA-seq样本中，CAF是与肿瘤细胞相互作用的主要细胞群，其中HSC-CAF的受配体对最多，同时，scRNA-seq人的ICC和肝门胆管癌(CCA)样本也证实了HSC-CAF的主导作用。此外还发现高panCAF标记以及高ACTA2 mRNA表达与ICC患者的存活率降低和复发风险增加有关。
图片
大多数CAF为HSC源性并与ICC肿瘤细胞紧密相互作用
为了将这些发现扩展到肝脏以外，接下来分析了KPC诱导的胰腺导管腺癌(PDAC)CAF的scRNA-seq 数据，并确定了胰腺星状细胞(PSC)-CAF和间皮CAF亚群。PSC-CAF仅弱表达HSC标记，但它们与HSC-CAF共享大多星状细胞(SC)的基因标记。与ICC中的门脉成纤维细胞(PF-CAF)相似，PDAC中的间皮CAF高表达Msln、Upk1b、Upk3b和Gpm6a。这些数据表明胰腺和肝脏中的CAF个体发育相似，这与两个器官都含有SC的发现一致。
image.png
对比ICC和PDAC中的CAF
2. HSC源性的CAF促进ICC增长
为了阐明CAF在ICC中的功能，在小鼠模型中耗竭HSC-CAF或aSMA+CAF，可使CAF降低多达85％，同时纤维化程度降低。结果发现耗竭CAF会抑制ICC的发展。耗竭CAF的小鼠表现出显著降低的肿瘤细胞增殖，而肿瘤中凋亡却没有改变或减少。CAF耗竭和非耗竭的小鼠中都只有少量CD3+T细胞浸润，且两者淋巴细胞和髓细胞亚群没有显著差异。敲除调节CAF介导的炎症和肿瘤生长作用的核因子kB(NF-kB)，发现并没有减少ICC的生长。表明了CAF与肿瘤的直接作用触发了肿瘤细胞的增殖，这可能是CAF促进ICC生长的主要机制，而细胞凋亡、适应性免疫或炎症似乎仅起较小作用。
图片
HSC来源的CAF促进ICC的发展和肿瘤细胞增殖
3. CAF不依赖于I型胶原蛋白促进肿瘤生长
接下来探索HSC来源的CAF促进ICC增长的介质。通过scRNA-seq分析了鼠CAF和人CAF，发现了富集炎症和生长因子的CAF(iCAF)、myCAF以及表达PF/间皮标记物的间皮CAF(mesCAF)亚群。iCAF表达高水平静息标记和低水平活化标记，并且富集炎症、生长因子、抗原呈递基因和通路。myCAF比iCAF表达更低的静息和更高的活化标记。使用Rgs5标记iCAF，Col1a1-GFP和SERPINF1标记myCAF，在原位证实了myCAF和iCAF亚群的存在。在小鼠ICC和人ICC和CCA的CellPhoneDB配体-受体分析中，myCAF和iCAF与肿瘤细胞都具有强烈相互作用。
图片
ICC中的CAF亚群以及他们的受体-配体相互作用
接下来首先将I型胶原作为ICC中myCAF调节肿瘤生长的候选介质。与静息HSC相比，Col1a1在鼠和人ICC的CAF中强烈上调，scRNA-seq和CellPhoneDB分析表明Col1a1在myCAF中富集，而其同源受体DDR1在肿瘤细胞中表达，这表明COL1A1-DDR1是myCAF与肿瘤细胞之间除了胶原蛋白介导的机械敏感信号以外的联系。然而，在ICC模型的HSC-CAF中敲除Col1a1，尽管刚性和机械敏感信号降低，但并未抑制肿瘤的生长，敲除胶原受体编码基因Ddr1也是同样的结果。以上表明，COL1A1和DDR1都不是ICC增长所必需的。
图片
Col1a1影响肿瘤刚性但不影响ICC的肿瘤生长
4. 肌成纤维细胞CAF(myCAF)通过透明质酸合酶2促进肿瘤生长
接下来进一步研究了不依赖COL1A1通路的myCAF促进肿瘤生长的机制。着眼于myCAF中差异表达的基质基因，确定了透明质酸合酶2(Has2)是myCAF中上调最多的基因之一，CellPhoneDB分析显示，在各种细胞类型上有多种HA受体。与CAF中Has2 mRNA的高诱导相似，透明质酸(HA)在两个ICC模型均很丰富，并且在HSC-CAF耗竭后大量减少。与CAF耗竭小鼠一致，Has2敲除的肿瘤显示出肿瘤细胞增殖显着降低。此外，在肝细胞/肿瘤细胞区室敲除被广泛认为是HA主要受体的Cd44并没有减少ICC的发展。结合CellPhoneDB分析表明，HAS2通过与CD44以外的非肿瘤细胞或受体相互作用介导其促肿瘤作用。
图片
myCAF来源的HAS2介导促肿瘤作用
5. 炎性CAF(iCAF)通过HGF-MET促进ICC
CellPhoneDB分析可以发现iCAF与肿瘤细胞具有强烈相互作用。为确定iCAF调控ICC生长的候选基因，分析了配体-受体相互作用的scRNA-seq数据，重点研究了差异表达的细胞因子和生长因子，发现了与肝脏再生和TME高度相关的肝细胞生长因子(HGF)-MET配体-受体对。与iCAF中Hgf的强表达互补，其受体Met在肿瘤细胞高表达，是将CAF直接关联到肿瘤细胞的候选配体-受体对。接下来，在ICC小鼠模型中敲除CAF中的Hgf，显示出ICC进展减少；敲除肝细胞/肿瘤区室中HGF的受体Met，发现ICC的生长显著降低。类似的，scRNA-seq证实了人ICC和CCA中iCAF的HGF高表达，MET在肿瘤细胞中表达，iCAF表达的HGF和肿瘤细胞的MET相互作用。这些发现表明，HGF-MET轴是关键的促肿瘤配体-受体对。
图片
结 论
该研究确定了ICC中CAF的来源和功能，并发现了不同的CAF亚群，这些CAF亚群可通过不同的介质促进ICC的生长。因此，CAF及其介质可作为ICC的治疗靶点。
参考文献
1. Affo, S., Yu, L.X., and Schwabe, R.F. (2017). The role of cancer-associated fi- broblasts and fibrosis in liver cancer. Annu. Rev. Pathol. 12, 153–186.
2. Algul, H., Treiber, M., Lesina, M., Nakhai, H., Saur, D., Geisler, F., Pfeifer, A., Paxian, S., and Schmid, R.M. (2007). Pancreas-specific RelA/p65 truncation increases susceptibility of acini to inflammation-associated cell death following cerulein pancreatitis. J. Clin. Invest. 117, 1490–1501.
3. Aparicio, L., Bordyuh, M., Blumberg, A.J., and Rabadan, R. (2020). A random matrix theory approach to Denoise single-cell data. Patterns (N Y) 1, 100035.
4. Banales, J.M., Marin, J.J.G., Lamarca, A., Rodrigues, P.M., Khan, S.A., Roberts, L.R., Cardinale, V., Carpino, G., Andersen, J.B., Braconi, C., et al. (2020). Cholangiocarcinoma 2020: the next horizon in mechanisms and man- agement. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 17, 557–588.
[苏州新格元生物科技有限公司]昨天
