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单细胞mRNA测序一直是科学家关注的一个热点。目前市场主要有2种建库方法，分别是Clontech公司推出的SMART法，和EpiCentre公司推出的TargetAmp方法。

要实现单细胞mRNA测序，需要解决2个难题。

第一个难题：PCR偏差

第一个难题就是一个人类细胞当中，它的总RNA量大约只有10pg左右（1pg=10^{-12g）,中的mRNA的量大约只有0.2个pg。要把那么少的mRNA转变成约零点几个μg（1μg=10}-6g）以上的核酸文库，这意味着核酸的扩增量要达到几百万倍以上。如何能在这个核酸扩增过程当中不引入太多的PCR偏差，就一直是个大问题。

PCR偏差，就是在PCR扩增过程当中，某些片段被大量扩增，而大部分片段被扩增的量很少，甚至根本就没有被扩增。结果就导致高通量测序，只能测到这所有样本当中很少一部分的片段序列。

PCR偏差会随着PCR循环的次数的增多而指数放大。那么，在这种情况下，一方面要把核酸扩增几百万倍，甚至更多的倍数；另一方面，又想得到均一覆盖的文库，这就是单细胞mRNA建库当中，所要解决的第一个大难题。

第二个难题：去除核糖体RNA

第二个难题是如何能尽可能高效地得到“mRNA”的文库，而不是含了大量“rRNA”序列的文库。因为rRNA在总RNA当中占了95%，甚至更高的比例，而mRNA在总RNA当中只占2~3%的比例。如果不加区分地进行逆转录，再扩增、建库很可能测序得到的绝大部分序列都是rRNA的序列。

但是 rRNA序列不能给我们带来有效的生物信息，它是无用的。而只有测到mRNA的序列，才是我们想要的信息，这样，如何能够选择性地把mRNA转化成测序文库，并且避免把rRNA带到测序文库中来，这就是单细胞mRNA测序当中，要解决的第二个大难题。

接下来，我们就来介绍SMART方法和TargetAmp方法，是分别如何解决上述2个大难题的。

SMART方法

我们先来介绍Clontech公司推出的SMART方法。SMART方法的全称是Switching Mechanism at 5’ End of RNA Template。这张图就是SMART方法的原理图。

SMART方法最核心的技术，就是设计了2个特殊的引物。再配合用MMLV逆转录酶进行逆转录。

我们先来看这个逆转录的起始引物。它哪，先是一段通用序列，未来这个通用序列会用作PCR扩增的引物识别序列，中间是一长串的T，这些T是专门识别mRNA的3’末端的Poly(A)尾巴序列。它会和这些Poly(A)尾巴互补结合，引物的最末端有一个定位的结构，这个定位的结构，就是在它的3’末端的倒数第2个碱基是一个非T的简并碱基。

图中用V来表示这个碱基。V碱基就是或A、或C、或G，但是非T的这样一个（简并）碱基。最后1个碱基则是简并碱基N，也就是A/C/G/T都有可能。引物的这个末端结构，就是让它正好结合在mRNA的3’端连到Poly(A)尾巴的这个连接处，而不会结合到mRNA的别的地方。这样就保证了逆转录的起始位置正好是mRNA的3’端的序列终止位置。

我们再来看这个MMLV逆转录酶，这个酶有个特点，就是它在转录到mRNA的5’端末端的时侯，会在新合成的cDNA的3’末端，多加出几个C碱基来。

再接下来，这个上游引物会发挥它的作用。这个上游引物，它有一个特点，它的3’端是3个非脱氧的G碱基，也就是核糖核酸的、RNA的G碱基，而不是DNA的G碱基，这个引物可以与刚才新合成的cDNA的3’端的那几个C碱基发生互补杂交，然后引导这个MMLV酶再次发挥聚合作用，以刚才那条新合成的cDNA为模板，复制的结果，就是得到双链的cDNA。

这个双链cDNA，两端都已经接好了我们人工设计的PCR引物序列，然后，就加入常规的PCR引物，进行常规的PCR扩增，常规PCR扩增，得到大量DNA。然后可以象常规的DNA建库那样，超声打断、建库、上机测序了。

我们回顾一下这个过程，可以看到这个方法的3个巧妙点。

• 第1点，是先用一个定位引物，保证cDNA的合成是从mRNA的3’最末端开始的，同时让合成出的cDNA在下游连上了一个通用PCR序列。

• 第2点，是利用MMLV逆转录酶会在新合成的cDNA的3'端，多加上几个C碱基的特点，再用有3个G碱基的上游引物进行第二链的合成。这就保证只有完整的第一链cDNA也就是那些带多个“C”的cDNA（第一链）才能被合成出cDNA的第二链，这也就保证了双链cDNA是全长的cDNA。

• 第3点，就是要保证PCR扩增的效率的一致性那我们知道，PCR扩增效率的最主要的影响因素是引物的序列，现在因为cDNA的5’端和3’端的都分别引入了统一的引物序，所以，这就去除了因为引物序列的不同。而引起PCR效率不同的，这个最主要的偏差因素。这也就在较大程度上保证了PCR扩增效率的一致性，减少了PCR偏差。

经过实验发现，用SMART方法，对于1个细胞，也就是10pg总RNA的RNA进行建库测序，RPKM为10的这些基因，有60%是被测序测到的；对RPKM为100的基因，有90%可以被测序测到。而且被测到的几率，波动很小。这说明SMART方法是一个有效的单细胞mRNA测序方法。

TargetAmp方法

接下来，我们介绍第2个单细胞mRNA建库的方法--TargetAmp方法，这个方法是由Illumina公司旗下的EpiCentre公司开发的。这个就是TargetAmp的原理图。

首先是用T7-Oligo(dT)的引物进行cDNA合成。这个引物，在5’端有设计了一个T7启动子序列。3’端是多个的T碱基，这一串T碱基可与mRNA的poly(A)尾巴相结合，作为逆转录的起始引物，经过逆转录，得到第一链的cDNA。同时这条cDNA链上，被引入了一个T7启动子。

然后用RNase H酶把cDNA:RNA双链产物中的这个RNA链消化掉，接着再合成出第二条cDNA链来，这个双链的cDNA就可以作为转录的模板。利用链上的T7启动子，转录出大量的反义RNA来（antisense-RNA，aRNA）。

接着，将这些反义RNA进行纯化。再用随机引物进行逆转录，得到第二轮的cDNA，接着，再用T7-Oligo(dT)这个引物，粘到第二轮的cDNA的Poly(A)尾巴上，再合成出双链DNA来。

这个双链的cDNA再经过第二轮的转录，又得到第二轮的反义RNA，这些第二轮的反义RNA的量，足可以达到微克级。再经过一轮逆转录，就可以得到几个微克的cDNA。那么几个微克的cDNA，就足以进行建库、测序之用了。

我们来看TargetAmp方法的巧妙之处：它不是用PCR来扩增核酸，而是用转录的方法来增加核酸的量。因为扩增那么多（倍）的核酸，如果用PCR，要用几十个循环，那么PCR不同的扩增子的扩增效率，即使一开始是很小的差异，也会在几十个循环中，被指数放大，变成一个很大的差异。那么TargetAmp方法用转录的办法，而且统一都用T7这个统一的启动子，它转录的启始效率，大体上就保持了一致。它的每一轮转录，都把核酸的量扩大几千倍。经过这样两轮的扩增，就把核酸的量扩大了几百万倍。这样，一方面它得到了高达几微克的核酸。足够用于建库，同时又避免了PCR过程，也就避免了PCR扩增偏差。

单细胞mRNA测序方法，在循环肿瘤细胞研究、胚胎发育研究、和神经活动研究方面，有着广泛的应用。随着高通量测序的费用不断地降低，它正变成科研中越来越普及的研究手段。相信有更多单细胞mRNA建库方法，和更新的技术应用会不断地被开发出来