基于质谱的蛋白质鉴定，第3节：基于MALDI-MS肽指纹图谱的蛋

自从将质谱（mass spec, MS）引入蛋白质分析中以来，肽指纹图谱（peptide mass fingerprint, PMF）分析已成为高通量蛋白质鉴定的首选方法。在肽指纹图谱PMF分析方法中，来自二维凝胶电泳纯化的目标蛋白质，无论是通过酶水解还是化学裂解，最后都是通过质谱技术对所得的肽混合物进行分析。分析得到的肽指纹图谱与通过理论裂解数据库中存储的蛋白质序列而获得的无指纹图谱进行比较，检索得分最高的蛋白质作为可能的候选蛋白质。与其他电离技术（如ESI）相比，MALDI可以容纳分析物混合物中适度的缓冲液和盐浓度，几乎只产生单电荷离子。基于这些原因，MALDI已成为肽指纹图谱PMF分析的首选电离技术。在90年代初期，几个研究小组报告了使用MALDI-肽指纹图谱PMF进行敏感蛋白质谱鉴定。结果表明，准确鉴定蛋白质只需要少量精确测量的肽指纹图谱，并且使用这种技术可以鉴定出凝胶中分离的pmole~fmol量级别的蛋白。网上各类基于PMF的数据库搜索引擎，如MOWSE (http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowse), ProfFound (http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound), PeptIdent (http://www.expasy.ch/tools/peptident.html) 和PeptideSearch (http://peptsearch.Protana.- com/FR_PeptideSearchForm.html), 很好地说明MALDI-PMF的成功。

将时滞聚焦技术（time-lag focusing）引入MALDI-电子飞行时间（RETOF）-质谱的离子源中，可以更准确地确定肽指纹。肽的质量准确度可高达几ppm，极大地提高了PMF的成功率，甚至可以对蛋白质混合物同时消化后进行蛋白质谱鉴定。MALDI-MS分析和基于肽指纹图谱PMF的整个蛋白质谱鉴定过程可以完全自动化，从而实现高通量蛋白质组学分析。在肽指纹图谱PMF分析中，将一组实验获得的肽指纹图谱与数据库中可用的蛋白质序列的理论指纹图谱进行比较，这种类型的分析在很大程度上取决于数据库中存在的蛋白质序列。尤其是当需要对仅具有的有限数量的基因组序列数据的物种的蛋白质进行蛋白质谱鉴定时（如大多数哺乳动物的情况一样），这种方法的成功率可能会很低。对于此类样品，明确的蛋白质谱鉴定需要额外的序列信息，才能最终成功鉴定。我们将在下一章中介绍，对特定肽段进行MALDI-PSD分析后获得的结构信息，能够对基于PMF获得的蛋白鉴定提供帮助（图1）。

图1：质谱鉴定凝胶分离蛋白的流程图。凝胶内蛋白水解后，将一部分消化后的混合物纯化后，用beads进行浓缩，用于MALDI-MS-PMF分析。如果鉴定失败，则将剩余的肽混合物在RP-HPLC色谱柱上分离，自动分级后对目标肽进行MALDI-PSD分析。当获得的PSD光谱未成功在蛋白质或EST数据库中鉴定到时，可以通过ESI-串联对该肽段进行从头测序。

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文献参考：Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis, 2000.