需求

  由于某些特定的环境，可能老师能够得到完整的细胞核，得不到完整的细胞，但是又想研究其细胞的单细胞转录组，就只能用细胞核进行10xGenomics单细胞转录组分析；或者有的老师就想研究细胞核内的mRNA与胞质mRNA（或者成熟mRNA）的差异或者调控的差异，也需要研究细胞核的mRNA。

方法策略

  不管是细胞核内还是胞质的mRNA，本质都是mRNA，都是从基因组上转录下来的序列，序列有相同的也有不同的，我们现在研究细胞核的mRNA，就需要考虑他们之间的差异，我们为什么不能直接用胞质mRNA的方法研究细胞核mRNA呢？主要是由于细胞核内的mRNA不是成熟的mRNA，是前提mRNA，除了有外显子序列以外，还有很多内含子（mRNA加工过程简介），而10xGenomics单细胞转录组比对的时候是考虑的外显子比对，因此如果直接用胞质mRNA比对方法进行细胞核mRNA比对，将会比对率低的情况。

pre-mRNA to mRNA

  针对这个问题，10xGenomics官方提供了解决方案：Cell Ranger compatible "pre-mRNA" reference，既然是由于外显子比对的问题，那么就解决比对情况即可。因此10xGenomics官方建议我们直接在修改参考基因组，直接提取gtf中第三列为transcript的行，然后将transcript改成外显子，这样这些聚类就是基因组上序列，包含了内含子序列。

  建议命令：

awk 'BEGIN{FS="\t"; OFS="\t"} $3 == "transcript"{ $3="exon"; print}' \
       refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0/genes/genes.gtf > GRCh38-1.2.0.premrna.gtf
#完成对gtf文件进行处理后，然后重新生成参考基因组，命令如下
cellranger mkref --genome=GRCh38-1.2.0_premrna \
                   --fasta=refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0/fasta/genome.fa \
                   --genes=GRCh38-1.2.0.premrna.gtf

然后用新的参考基因组进行比对，做后续分析。

结果比较

  为了比较评估此方法的可行性，我们用新生成的参考基因组(mRNA)和之前普通的10xGenomics参考基因组(pre_mRNA)进行分别进行分析，然后看结果的差异。

mRNA
pre_mRNA

  从上述两个图看出，二者之间的结果差异挺大，主要体现在基因中位数，

mRNA：759
pre_mRNA：2123，
造成这个原因是比对到转录本的序列多少不同，其中比对到转录本的比对率(Reads Mapped Confidently to Transcriptome)分别为：
mRNA：17.6%
pre_mRNA：63.1%
  从上述结果来看，如果研究细胞核mRNA或者说研究前体mRNA，按照上述方法对参考基因组进行处理是很有必要的。

参考文档

Cell Ranger compatible "pre-mRNA" reference

2019年6月3日