线粒体动力学和功能的变化以及心脏组织中的 mRNA/miRNA
Changes in the Mitochondrial Dynamics and Functions Together with the mRNA/miRNA Network in the Heart Tissue Contribute to Hypoxia Adaptation in Tibetan Sheep
DOI: 10.3390/ani12050583
Simple Summary
长期暴露在缺氧环境下，是细胞压力的主要来源，可诱发与缺氧有关的疾病，甚至死亡。线粒体在介导对缺氧的能量生产反应中起着重要作用，但对其中的机制知之甚少。藏羊主要分布在青藏高原，经过长期的适应，藏羊对缺氧有很好的适应性。在这项工作中，我们对不同海拔地区藏羊的血液指标、组织形态、mRNA和miRNA表达调控以及线粒体功能的变化进行了系统分析，以深入了解动物对缺氧的适应机制和缺氧相关疾病的进展。
摘要
本研究旨在通过探索不同海拔藏羊的缺氧适应机制、血液指标、组织形态学、mRNA/miRNA调控、线粒体动力学和功能变化，为缺氧条件下的分子调控和线粒体功能提供新见解。血液指标和心肌形态学方面，高原绵羊的 HGB、HCT、CK、CK-MB、LDH、LDH1、SOD、GPX、LDL 水平和心肌毛细血管密度显着升高（ p < 0.05 ）。RNA-seq 结果表明，DEmRNAs 和 DEmiRNAs 主要与 PI3K-Akt、Wnt 和 PPAR 信号通路以及癌基因（CCKBR、GSTT1、ARID5B）的上调有关) 和肿瘤抑制因子 ( TPT1、EXTL1、ITPRIP ) 来增强细胞代谢并增加 ATP 的产生。分析 mRNA-miRNA 协同调节表明线粒体动力学和功能显着丰富。通过分析线粒体动力学，随着海拔升高，心脏中的线粒体融合显着增加，裂变显着减少 ( p < 0.05)。随着海拔的升高，线粒体密度显着增加，单个线粒体嵴的平均面积、纵横比、数量和宽度显着降低（p< 0.05)。随着海拔升高，各组织中NADH、NAD+和ATP含量、NADH/NAD+比值和CO活性显着升高，而SDH和CA活性显着降低（p< 0.05)。因此，发现藏羊血液指标和心肌形态的变化可以提高血红蛋白携带氧气的效率并减少氧化应激。癌基因和抑癌因子的高表达可能促进细胞分裂和能量交换，这从增强的线粒体分裂和 OXPHOS 表达中可以明显看出；然而，它减少了融合和 TCA 循环，以进一步快速产生 ATP 以适应缺氧胁迫。该系统研究首次阐明了藏羊心脏缺氧适应机制，对于提高哺乳动物缺氧适应能力和研究线粒体在缺氧条件下的动态调控具有重要意义。
介绍
氧气是哺乳动物正常有氧代谢所必需的，主要是线粒体有氧代谢产生三磷酸腺苷（ATP）以维持细胞的正常生理功能。缺氧是自然界中普遍存在的自然现象。氧气浓度随海拔升高而逐渐降低，海拔4000米处的氧气含量仅为海平面的60% [ 1]. 长期处于高原缺氧状态，导致细胞供氧不足，导致动物组织损伤甚至死亡。同时，缺氧在癌细胞的发育过程中更为常见。由于恶性增殖，癌细胞相互竞争氧气，导致缺氧微环境。目前，许多抗癌药物的研究都是针对癌细胞的能量代谢[ 2 ]。因此，研究缺氧适应机制对于提高动物适应缺氧能力和肿瘤相关医学研究具有重要意义。
长期暴露于缺氧环境会诱发各种以红细胞增多症和肺水肿为特征的急性高山病 (AMS)。[然而，藏羊 3 ] 和藏猪 [4]等高原本土哺乳动物的长期适应性进化]从形态结构、生理生化、遗传学等方面保证了它们对高原缺氧的系统适应。藏羊主要分布在海拔2500～4500米的青藏高原及邻近地区。据报道，它们是经过长期适应后从野生绵羊中衍生出来的，其种群数量估计超过5000万只。此外，这些羊不仅能很好地适应高原缺氧环境，还能为当地牧民提供肉、毛、奶，成为当地牧民的主要经济来源之一[ 3、5 ]。这些特性使藏羊成为研究缺氧适应的理想模式生物。
近年来，据报道转录组学在揭示许多细胞事件方面具有重要作用。转录分析揭示了适应缺氧环境所需的缺氧调节因子的差异表达 [ 6 ]。据报道，缺氧诱导因子 1 (HIF-1)、磷酸肌醇 3-激酶-Akt (PI3K-Akt) 和过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) 信号通路 [7、8 ]与缺氧密切[相关]并且miR-21-5p [ 9 ]、miR-200b/C[ 10 ] 和 miR-21[ 11 ]等 miRNA已被证明在调节缺氧中发挥重要作用。
葡萄糖代谢和糖酵解的变化被上调以产生 ATP 以抵抗缺氧应激 [ 12 ]。线粒体是具有其基因组和转录系统的双层膜细胞器。它可以利用三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化（OXPHOS）产生细胞所需的大部分ATP（95%）以满足细胞的能量需求[ 13 ]。同时，线粒体还调节活性氧 (ROS) 的产生和储存、钙稳态和细胞凋亡 [ 14、15 ]。线粒体动力学是细胞适应缺氧的一个重要方面。融合和裂变的速率受视神经萎缩 1 (OPA1)、动力蛋白相关蛋白 1 (Drp1) 和裂变 1 (Fis1) 等关键蛋白的调节 [ 16、17 ]。线粒体融合与裂变在生理条件下相互制约，使线粒体达到一定的动态平衡，补充和修复线粒体DNA（mtDNA），调节TCA循环和OXPHOS，为细胞提供能量，满足细胞的能量需求。[ 18 ]。破坏这种平衡，即当线粒体融合和分裂受阻时，会导致多种疾病 [ 19 ]。
目前对缺氧适应的研究主要集中在血液指标、组织形态学和基因表达等方面，以线粒体为切入点通过能量传输进行缺氧适应的研究较少。因此，本研究以藏羊为模型，将其带到不同海拔高度（不同氧浓度），分析心脏mRNA和miRNA的表达谱，结合线粒体动力学和功能，探讨缺氧适应机制，从而为发展畜牧业和防治缺氧相关疾病提供参考。
(个人关注讨论部分，结果和方法见原文)
讨论
4.2. 缺氧条件下 mRNA 和 miRNA 的适应性调节
基因对于调节表型很重要，例如 VEGF 的表达和HIF-1a和HIF-1b的共表达，促进血管生成和纤维化以增加对组织的供氧 [ 36 ]。基于mRNAs/miRNAs的缺氧研究主要集中在人类癌症[ 37 ]、藏猪[ 20 ]和水生生物[ 38 ]，而藏羊研究较少。在这项研究中，TS25、TS35 和 TS45 中的藏羊平均产生了 41.22、41.32 和 4315 万个 clean reads，与 Lin 等人获得的约 4700 万个 clean reads 的结果相似。[ 39] 在山羊肌肉组织中。尽管RNA来源不同，但相似的结果表明测序结果可用于后续研究。通过测序共获得18140个mRNA，然后对三组中的DEmRNA进行鉴定并注释其功能。在 TS25-vs-TS35 和 TS25-vs-TS45 结果中，5 个最显着的差异表达基因主要与癌症相关并在致癌过程中起作用（白血病、胃癌、乳腺癌等）（CCKBR 、 GSTT1 、 ARID5B ） , TPT1 , EXTL1 ), 抗氧化剂 ( GPX1 , SELENOW ), 血管生成 ( ANGPTL2 , PTX3), 和红细胞形态学 ( SELENOW )。然而，癌症相关基因的高表达并不代表癌症的发病率高，也不代表细胞为了满足组织细胞的能量需求而高表达而处于更高的代谢水平。王等(2019) [ 40 ] 在鹿研究中发现癌症相关基因和通路被显着注释以满足鹿茸组织的快速生长。同时，抑癌基因也被强烈选择，这解释了为什么癌症和抑癌基因在我们的结果中显着丰富。此外，TS35-vs-TS45结果中差异表达最显着的基因主要与血管保护相关（Nr4a3，SCN3B )和维持或改变组织形态( DDIT4L , Myh6 )，这可能是由于海拔3500米到4500米急性缺氧应激的适应阶段，类似于癌细胞增殖的缓慢后期。例如，SCN3B在 TS35 羊中的表达量是 TS45 羊的 10.46 倍，较低的SCN3B表达量可以保护颅内动脉内皮细胞免于心肌动脉粥样硬化 [ 41]. 适当的心肌肥厚可以增强心脏功率，加速血流和组织供血，是组织因缺氧应激而产生的代偿性变化。作为组织对缺氧反应的代偿性变化，适当的心肌肥厚可增强心功率。研究已经确定DDIT4L的表达促进心肌肥大以应对压力 [ 42 ]。
分析 GO 和 KEGG 以更好地了解 DEmRNA 的功能。结果表明，DEmRNAs主要富集于癌症、PI3K-Akt、PPAR、MAPK、钙离子、camp、代谢等缺氧相关通路，在细胞内发挥结合、催化和分子调控等相关功能。 、细胞器和细胞膜响应生物调节和应激等生物过程。这些途径已被注释为在缺氧和癌细胞发展中具有重要的调节作用 [43]]. 值得注意的是，癌症通路中的microRNAs在不同的缺氧胁迫下显着富集，这也说明miRNAs在缺氧过程中发挥着重要作用。miRNA通过与靶mRNA的某些碱基配对来降解或抑制mRNA翻译，从而在调节基因表达中发挥负面作用[ 44 ]。因此，对不同海拔条件下藏羊心脏miRNAs的转录组谱进行了测定，共获得1046个miRNAs。为了进一步了解 miRNA 调控，分析了 DEmiRNA 和 DEmRNA 之间的关联，并构建了共表达网络。
网络中 mRNA 功能的分析表明，虽然大多数与 miRNA 相关性最强的 mRNA 也与癌症和肿瘤发生有关，但这些 mRNA 与葡萄糖代谢和氧化磷酸化（ MRPL28 、 ALDH1L2 、 ECI1 、 PDP2 ）更具体相关和线粒体动力学（TIMM8A、MTFP1、Fis1、ErbB）。例如，作为一种线粒体蛋白，MRPL28可以作为开发胃癌新药的靶点[ 45 ]。PDP2高表达能抑制丙酮酸脱氢酶 (PDH) 的活性，进而减弱线粒体中利用丙酮酸减弱细胞呼吸和 OXPHOS 的强度 [ 46 ]。本研究中PDP2的表达随海拔升高而降低，这可能与线粒体OXPHOS有关。根据网络中靶基因的功能注释，主要位于线粒体的mRNA参与癌症、Wnt、cAMP、FOXO、ErbB和钙调节信号通路，在血管生成、蛋白磷酸化和线粒体动力学中起关键作用规定。Ludikhuize 等(2020) [ 47]发现FOXO和Wnt信号通路在Lgr5+柱状细胞（CBCS）的线粒体裂变中发挥重要作用，导致干细胞分化为杯状细胞。EGF/ErbB信号通路在缺氧条件下被激活，诱导磷酸甘油酸激酶1（PGK1）S203磷酸化并转移至线粒体，从而导致丙酮酸脱氢酶激酶磷酸化，从而增强丙酮酸向线粒体和TCA的转移周期 [ 48 ]。在本研究中， PGK1的表达与 TS25 羊相比，TS45 羊中的 1.59 倍下调，表明丙酮酸向线粒体的转移减弱。从构建的网络图中，线粒体被识别为调节与适应缺氧条件相关的动力学和功能。因此，在缺氧条件下分析了线粒体动力学和功能的动态变化。
4.4 缺氧条件下 TCA 循环下调，OXPHOS 上调
我们之前的研究发现HIF1A和PDK4协同表达促进糖酵解[ 12 ]。作为一种激酶，PDK4 使丙酮酸脱氢酶氧化和脱羧以降低其活性，最终减少 CA 合成。本研究中 CA 含量随着海拔高度的增加而显着降低，这表明 TCA 循环可能在缺氧条件下减弱。本研究中PDK4的表达与 CA 含量呈负调控关系，证明缺氧条件下 TCA 循环可能下调，减少癌细胞中 TCA 循环以减少耗氧量也是适应的重要调控策略。缺氧 [ 59]. OXPHOS主要依赖于线粒体内膜呼吸链的四种复合物和ATP合酶。OXPHOS 率的变化可以通过根据海拔测量关键复合物的含量/活性来识别。复合物 1 (NADH) 是呼吸链中最大的。在这项研究中，NADH 和 NAD+ 含量随着海拔高度的升高而显着增加，表明 OXPHOS 可能被上调。因为细胞内NAD的氧化还原状态是调节糖代谢的关键因素[ 60 ]，高NADH/NAD+含量表明OXPHOS上调，NAD+活性的增加也可以增强线粒体功能，增加ATP的产生[ 61]. Complex 2 (SDH) 是电子进入呼吸链的第二个独立入口。虽然SDH本身不产生质子，但它可以直接氧化琥珀酸，将电子转移给辅酶Q[ 62 ]。在这项研究中，SDH 的活性随海拔升高而降低，并在心脏、肺和股四头肌中达到显着水平。缺氧条件下 SDH 活性的降低会减少琥珀酸的氧化，从而减少 ROS 的产生并降低线粒体膜维持线粒体功能的潜力 63 []。
TCA 循环的减少减少了质子进入线粒体膜间隙的产生，这进一步降低了膜电位。此外，SDH 活性的降低也可能与 TCA 循环减弱有关，这会降低琥珀酸和 SDH 活性。复合物 4 (CO) 是唯一的组织特异性复合物，参与调节发育。作为限速酶，有一个伴随的作用来调节 OXPHOS 的速率 [ 64]. 发现所有五种组织中的 CO 活性显着增加，这证明 OXPHOS 过程在缺氧条件下显着上调。然而，确定单个线粒体嵴的数量和宽度的减少是否可以降低 OXPHOS 水平。推测 TS45 藏羊中存在更多线粒体。因此，全身线粒体嵴的数量和宽度可能会增加，表明 OXPHOS 水平得到改善。ATP含量需要显着增加以满足组织细胞的能量需求和抵抗应激，但缺氧条件下的产生机制尚不十分清楚。在所有组织中测量了 ATP 含量，并随着海拔高度的增加而显着增加。
虽然结果表明线粒体动力学和功能的变化在缺氧环境中起着重要作用，但动物死亡引起的压力可能会影响线粒体，许多麻醉剂和毒素对线粒体是致命的。因此，应尽可能减少外界环境对线粒体的影响。此外，虽然这项研究模拟了不同海拔高度的不同氧气含量，但由于物种特异性，结果可能不适用于其他哺乳动物或癌细胞的发展。因此，其他哺乳动物线粒体的变化还需进一步研究，但缺氧条件下藏羊线粒体的调控可以为缺氧相关疾病的治疗提供参考。
结论
综上所述，藏羊血液中红细胞和血红蛋白数量、抗氧化剂浓度和心肌毛细血管的增加可能会提高氧气运输效率并减少 ROS 造成的损害。根据mRNA-seq和miRNA-seq的结果，藏羊主要依靠PI3K-Akt、Wnt、PPAR信号通路上调癌基因和抑癌基因来增强细胞代谢，增加ATP的产生和从而抵抗缺氧引起的压力。这些基因主要通过调节线粒体动力学和功能来发挥这一作用，例如线粒体裂变增加，融合减少，糖酵解和 OXPHOS 上调，TCA 循环下调。
