文献学习042--[Organoids]建立用于药敏试验的PDO

2022-07-19 本文已影响0人 Hayley笔记

这一篇文章是类器官领域的先驱Hans Clevers教授2020年发表在Nature Protocols杂志上发表的关于PDO培养和药敏实验的文章。

Hans Clevers是第一个在肠道中鉴定出活干细胞的人，他是成人干细胞及其在癌症中的作用及其再生疗法潜力的全球领先研究者之一。Clevers通过培养肠道中存活的干细胞，开发出历史上第一个类器官，其与体内来源的组织或器官高度相似。类器官可以从许多类组织中培养出来，用于研究各种人体器官的生理功能和病理特征，对于研发新药和个性化的治疗方案具有巨大潜力。

延伸：Hans Clevers-类器官讲座

文章的三位作者都来自荷兰胡布勒支研究所 (hubrecht)，这是一个享誉全球的研究所，隶属于荷兰皇家艺术与科学院，该所有23个课题组，主要的研究方向集中在发育和干细胞生物学。

1. 类器官培养方法概述

PDO建立的基本流程：
首先获得组织。组织类型主要是三种：正常组织、肿瘤组织和活检组织。针对手术切除的组织在消化解离前需要先剔除没用的部分，也就是脂肪和肌肉组织。剔除之后进一步进行消化解离，取一部分保存进行分子生物学实验，剩余部分包裹在BME基质胶中，然后滴注到培养板上形成PDO，生长到一定程度之后进行传代和药敏实验。

作者在文章中以口腔粘液瘤为例进行了详细展示，首先取到组织，去除脂肪和肌肉组织后，用胰酶消化，每隔十分钟振荡重悬，解离时间不超过60分钟，然后用大量的培养基重悬，过100μm孔径的细胞筛，未消化完全的部分留在了细胞筛上方，用培养基清洗以去除胰酶，然后离心，用冷BME重悬，迅速滴注点板，BME胶凝固之后添加培养基进行培养，在第0、3、7天观察PDO的生长情况。

实验细节1：组织解离
上皮组织来源，组织来源（正常/肿瘤），建立该方法的研究所不同，建立类器官的培养流程也不同。归纳如下：

作者综述了33种已报道的组织消化解离的方法，主要是用机械破碎+酶消化的方法，用的比较多的是胶原酶、胰酶、DNA酶和解离酶，需要注意的是不同组织用到酶不同，消化时间也不同，肠类器官通常不要超过60min，否则会解离过度，而肝类器官则要解离2h，甚至过夜。

实验细节2：培养基

用于PDO培养的培养基的主要成分主要分为两类：一类是基础培养基，一类是另外添加的各种因子。
作者综述了近年来多篇文章的培养方案，发现在所有方案都选用DMEM/F12培养基作为基底，究其原因是因为DMEM/F12培养基适合克隆培养，还有较为丰富的营养因子。基础培养基之外的添加因子就会随着肿瘤类型的不同而发生变化，但基本上都会包含着四类因子：
1、Wnt信号通路激活剂；
2、酪氨酸受体激酶的配体，刺激上皮细胞增殖；
3、TGF-β信号通路抑制剂，抑制上皮细胞分化；
4、ROCK抑制剂 (Y-26732)，保持干细胞多能性。

PDO培养是3D培养，常用胶的类型主要为三种：R&D公司的BME，BD公司的Matrigel以及Sigma的Geltrex。这里主要介绍一下BME (Base membrane extract)胶，这是一种从小鼠肉瘤细胞中纯化出来的一种可溶性基底膜，低温条件下呈液态，37℃呈现固态。BME包含多种组分，对于维持干细胞或前体细胞未分化状态有重要作用，并不是单纯提供一种固态支持的作用。