多系通讯调控人肝芽的多能性发育(Nature, 2017)

Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency

传统的二维多能分化研究不能分化概括发生在器官发生过程中的细胞相互作用。三维类器官组织培养技术能够很好的在体外构建细胞构成复杂的类器官，结合单细胞转录组测序技术就能很好的研究器官形成过程中，各种细胞的相互作用。在这项研究工作中，该团队结合几种最新的研究技术，从三个层次的研究揭示了多系通讯调控人肝芽的多能性发育。

定向诱导多能干细胞分化成肝细胞的二维分化研究

该研究在定向诱导多能干细胞分化成肝细胞的过程中，从5个关键的时间节点上（day 0, iPS cells; day 6, definitive endoderm (DE); day 8, HE; day 14, immature hepatoblast-like (IH); day 21, mature hepatocyte-like (MH)）分离单细胞，进行单细胞测序。鉴定出不同时期，不同类型的细胞群。并利用关键基因，根据细胞间的成对关系，在相邻网络中推断出细胞间的谱系关系。分析中发现维持多能性的基因NANOG、SOX2、MYC在分化后6天停止表达，而控制内胚层形成的EOMES、CER1、CXCR4、FZD8基因大部分在第6天细胞中上调，内胚层细胞形成。到第8天，细胞群出现有明显的异质性，一些细胞在同一时间点比其他细胞在谱系中进展得更远。第14天，几乎所有的细胞(90%)都分化过DE或HE，并表达类似肝母细胞样状态(即AFP、TTR、RBP4)的特征基因。研究发现DE/HE细胞在谱系的早期与胚胎第8.5天(E)小鼠腹前肠的大量RNA-seq数据表现出较强的相关性，而IH / MH与E10小鼠肝脏的RNA-seq数据表现出较强的相关性。这表明二维肝细胞谱系的发生与体内肝发生在许多方面都具有相关性。

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肝芽类器官形成过程的三维分化研究

为了搞清由HE、内皮细胞(EC)和间充质细胞(MC)谱系组成的三维微环境如何影响三维肝芽类器官的发生的，研究人员将三种细胞谱系共培养24小时，研究MCs驱动三维多谱系组织形态的构成。对输入细胞(HE, ECs, MCs)的在关键时间点(LB发育3 - 4天，iPSC细胞后11 - 12天)取样，进行单细胞转录组测序。通过主成分分析中将HE- lb细胞投影到二维空间，发现HE- lb细胞相对于HE和IH处于中间成熟阶段，显著差异表达的基因参与细胞基质粘附、糖酵解、缺氧和细胞信号传导的过程中，深入发掘发现其中一些细胞表达上皮细胞迁移特征，包括PROX1和ONECUT2等基因出现高表达。这两个基因在体外的肝脏发育过程中，是肝细胞从内胚层上皮向间充质隔迁移所必需的。这些数据表明，3天LB内的HE细胞开始向肝细胞的命运成熟，并启动一个不同于同型2D培养中细胞生长程序。

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LB内皮细胞和MCs在LB形成过程中表现出强烈的转录组反应。EC-LB细胞在缺氧和内质网应激的信号通路中均有过表达，而增殖信号通路表达水平较低。EC-LB细胞中，一种血管生成的信号通路高表达，包括ACKR3、HIF3A、MMP2、ANG和ANGPTL4。这些内皮细胞的反应类似于损伤后肝脏再生过程中ECs的诱导阶段。MC-LB细胞基因的差异表达与缺氧反应和炎症反应相关。而研究表明缺氧能促进血管生成。

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为了进一步探索内皮细胞和间充质细胞存在下肝细胞的成熟，该研究在体外长期培养的LBs肝芽类器官的发育后期进行的单个肝细胞转录组(LB-late,7-13 days in 3D, 15-21 days after iPS cells, 173 cells total)。值得注意的是，在谱系重建中使用PCA分析，发现二维和三维肝系在LB生成后不久发生分叉，并在肝成熟过程中继续分化。差异基因表达分析显示，与二维分化细胞相比，LB肝细胞中许多参与线粒体翻译、细胞周期调控、细胞分化、信号传导和细胞骨架组织的基因表达上调。这些数据揭示了二维单系和三维多系LBs肝系分化过程中平行和发散的基因表达特征。

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胚胎发育过程中肝脏形成过程的研究

此外，该研究从胎儿(妊娠10.5周和17.5周)和成人肝脏(3名捐献者，年龄分别为21岁、55岁和65岁)中取样进行单细胞转录组测序分析。分析发现胎儿肝细胞和成体肝细胞分别聚在一起，在这两个聚类中有许多基因表达差异。该研究量化了iPS细胞来源的肝细胞样细胞与胎儿或成人肝细胞状态的相似性发现：与成体肝细胞相比，lb来源的肝细胞与胎儿肝细胞更相似。有趣的是，发现LB微环境中的ECs和MCs的表达更类似于胎儿内皮细胞和间充质细胞(星状细胞)，而不是输入对应的细胞。ECs和MCs是一种重要的肝细胞外成分不存于2D谱系。通过设计了一个在芯片receptor-ligand配对的信号机制的反应观察发现计算每种细胞和其他细胞都存在潜在的相互作用。MCs具有最大的潜在相互作用，HE细胞与MC和EC的相互作用多于与其他HE细胞的相互作用。进一步分析发现，肝、内皮和间充质谱系之间存在广泛的相互作用，其中涉及许多信号通路(包括肿瘤坏死因子、纤维母细胞生长因子(FGF), Janus酪氨酸激酶/信号传感器和激活转录(JAK / STAT) NF-κB, HIF和VEGF信号)。

该研究采用了两种策略来测试从该分析得出的预测。首先，使用siRNA敲除受体(TIE1)及其配体(EDN1)，它们都表现为EC限制性表达，参与EC和HE配对，并揭示了它们在血管生成中的作用。在这两种情况下，肝脏的分化都受到了损害。这说明EC活性影响HE分化。其次，该团队开发了一种使用小型LBs的高通量成像方法来检测通路抑制对LB发育的影响。检测了70种化学抑制剂在四个时间点(孵育24小时、48小时、72小时、96小时)的作用。发现，与DMSO对照组相比，部分化合物降低了肝脏与ECs的比值。如JAK3的抑制剂抑制了JAK/ STAT通路从而显著破坏LB的完整性。

综上所述，对二维和三维肝脏分化的scRNA-seq分析表明，这两个系统都反应了人类肝发生的某些转录特征。而LB的形成和成熟过程中，反映出了与发育中的人类胎儿肝脏中形似的转录表达过程。由于在二维同源培养中缺乏这些发育相关的特征，研究得出结论，人类LB类器官的发育和再生是由于异型细胞间交流的结果。