肿瘤免疫浸润评估软件—TIMER的使用简介
目前已有各种关于免疫浸润的计算方法。我们介绍过CIBERSORT，它是一种很有影响力的反褶积方法，利用带有预定义的免疫特征矩阵的微阵列数据来估计给定样本中22个肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)的比例。
今天我们介绍另一个交互式web工具—TIMER，能够全面、灵活地分析TIICs并可视化。
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背景介绍同一类型肿瘤的不同患者的免疫浸润具有异质性，可能影响临床结果。肿瘤基因组和宿主免疫系统具有复杂性，因此如何描述癌细胞与免疫浸润的相互作用仍是一个难题。
为方便研究肿瘤免疫和基因组数据，TIMER应用反褶积方法从基因表达谱中推断TIICs的丰度，重新分析了TCGA的32个癌症类型的10897个样本的基因表达数据，估计6个TIIC亚群(B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)的丰度。
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Figure 1：TIMER模块概述。上四个模块分别探讨TIICs与基因表达(Gene)、总体生存(Survival)、体细胞突变(Mutation)和体细胞拷贝数改变(SCNA)的关系，以及两组基因的差异表达(Diff Exp)和相关性(Correlation)分析。每个模块的可视化示例显示在相应的文本框中。最新升级到2.0版本（http://timer.cistrome.org/），将原来的Mutation模块分成了Mutation&Gene_Mutation两个功能子模块，Survival分成了Outcome&Gene_Outcome。另外由于TCGA中可用样本数量不同，评估分数与之前的版本会稍有不同。
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结果解析****01Immune Association(1) Gene:免疫浸润与基因表达间的相关性.
你选择任何感兴趣的基因与免疫细胞类型，该模块能够对基因表达与多种肿瘤类型中免疫浸润水平的相关性进行可视化。
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提交感兴趣的基因和免疫细胞类型后，将显示带有在各种癌症类型中纯度调整后spearman’s rho值的热图。颜色表示显著的正/负相关。
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单击感兴趣的单元格弹出一个散点图，显示浸润估计值与基因表达之间的关系。
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肿瘤纯度是该分析中的主要混杂因素，选择“Purity Adjustment”后将使用部分Spearman的相关值来进行此关联分析。
(2) Mutation:免疫浸润与突变状态间的相关性.
分析基因突变对（多种癌症类型和多种免疫细胞类型的）免疫细胞浸润的影响并可视化。输入基因后显示每种肿瘤类型的基因突变频率条形图。
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提供一个带有数字的热图表，输入基因发生突变的肿瘤与输入基因没有突变的肿瘤之间的免疫浸润水平的倍性变化对数值，不同方法计算出的估计值不同。
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单击热图上的单元格查看突变体与野生型肿瘤中免疫浸润分布的小提琴图（同一免疫细胞在同一癌症中经过两种方法计算的免疫浸润水平大致相同）。
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(3) sCNA:免疫浸润与体细胞CNV间的关联.
CNA模块可以通过跨肿瘤类型的基因的sCNA状态比较免疫浸润分布。随后出现一个堆积条形图，展示TP53在所有肿瘤类型中的不同sCNA状态的相对比例（堆积条形图以堆积条形的形式来显示同一图表类型的序列，既能看到整体推移情况，又能看到某个分组单元的总体情况，还能看到组内组成部分的细分情况）。
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TIMER2.0要求用户指定基因的“深度缺失”或“高扩增”改变状态，以与“二倍体/正常”状态进行比较。看下边两个热图表和小提琴图，不同sCNA状态下的免疫浸润分布有很大差别。
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High Amplification
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Deep Deletion
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(4) Outcome: 免疫浸润与临床结果的关联.
这个功能模块可以分析肿瘤免疫亚群的临床相关性，并校正多变量Cox比例风险模型中的多个协变量（协变量可以是临床因素或基因表达）。提交变量后，TIMER将进行cox回归分析，在热图中显示每个模型的标准化浸润系数。
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点击下载JPG。
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热图表的每个单元格都对应一个独立的Cox模型。单击显示相应免疫浸润和癌症类型的K-M曲线。浸润水平分为高低，通过滑块进行调整。
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KM曲线图上显示Cox模型的危险比HR和p值。
02Cancer Exploration(1) Gene_DE:肿瘤—正常样本中的差异基因表达.
箱线图显示基因表达水平；差异显著性（edgeR；*：p<0.05; **：p<0.01; ***：p<0.001）。
识别与正常组织相比在肿瘤中上调/下调的基因。
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(2) Gene_Outcome:基因表达与临床结果的关联.
使用Cox比例风险模型评估各肿瘤类型之间基因表达的临床相关性。
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单击热图的单元格将显示基因的KM曲线。
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(3) Gene_Mutation:基因突变状态间差异基因表达.
输入感兴趣的突变基因和基因列表。
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提交后，热图显示每种肿瘤类型中每个基因差异表达的变化。
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单击单元格显示小提琴图（A1CF在胶质瘤中的野生型TP53和突变的TP53的差异表达水平）。
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(4) Gene_Corr:基因间相关性.
探索感兴趣的基因与各肿瘤类型中基因集之间的相关性。热图展示相关程度。
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03Immune Estimation(1) Estimation: 对用户提供的表达数据进行免疫浸润评估.
需要输入表达数据（行是HGNC基因名，列是样本名，表达值要求TPM标准化且没有对数转换），文件不能超过50M。
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重新输入小于50M的表达数据，但sample>10时就没有图形展示了。
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我们使用一个10 samples的表达文件。
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点击RUN！运行，屏幕右下角出现进度条。
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结果展示：
①表格，免疫细胞在各样本中的丰度值。
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②条形图直观的展示样本间的免疫细胞浸润水平。
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③饼图展示了几种方法下每个样本中免疫细胞比例。
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小编总结
研究肿瘤与免疫相互作用需要对免疫浸润景观进行表征，这就需要创新的计算方法对多维数据集进行整合和反褶积。TIMER三大功能模块的直观输入和输出，对多癌型中特定基因和免疫细胞互作分析进行简化，更便于应用，为肿瘤免疫研究提供了一个全面的分析网络工具，你get了吗？
REF:Li T, Fan J, Wang B, et al. TIMER: A Web Server for Comprehensive Analysis of Tumor-Infiltrating Immune Cells. Cancer Res. 2017;77(21):e108‐e110. doi:10.1158/0008-5472.CAN-17-0307
