Complement activation assays

complement system

Protocol

1. 96孔酶标板使用以下物质包被4℃过夜：

• Classical pathway: 含2.5gµ/ml人免疫球蛋白（IgG）的Carbonate Buffer
• Alternative pathway: 含20µg/ml酵母多糖（zymosan）的Carbonate Buffer
• Lectin pathway: 含100µg/ml 甘露醣（mannan）的Carbonate Buffer

2. 每个孔用200µl的blocking solution室温下封闭2h。
3. 96孔酶标板使用以下物质孵育：

• Classical pathway: 含3%人类血清的DGVB²⁺ Buffer室温下孵育20min（检测C4b和C3b）
• Lectin pathway: 含3%人类血清的DGVB²⁺ Buffer室温下孵育45min（检测C1q和C9）
• Alternative pathway: 含5%人类血清的Mg²⁺EGTA buffer室温下孵育35min（检测C3b）或者37℃孵育1h（检测C9）

4. 使用适用于ELISA的C4b、C3b、C1q、C9室温下孵育1h。
5. 使用含HRP的相应二抗室温下孵育30min。
6. 使用1,2-phenylenediamine dihydrochloride检测490 nm处测定吸光度。

材料

1. wash buffer:
   50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
   150 mM NaCl
   0.1% (v/v) Tween 20

2. Carbonate Buffer:
   75 mM sodium carbonate

3. blocking solution:
   1% (w/v) BSA in PBS

4. DGVB²⁺ Buffer:
   2.5 mM Veronal buffer (pH 7.3)
   70 mM NaCl
   140 mM glucose
   0.1% gelatin
   1 mM MgCl₂
   0.15 mM CaCl₂

5. 人类血清

6. Mg²⁺EGTA buffer:
   2.5 mM Veronal buffer (pH 7.3)
   70 mM NaCl
   140 mM glucose
   0.1% gelatin
   7 mM MgCl₂
   10 mM EGTA

参考资料

1. Classical Pathway of Complement System
2. Scabies Mite Inactivated Serine Protease Paralogs Inhibit the Human Complement System