半胱氨酸耗竭诱导小鼠胰腺肿瘤铁死亡（一）
本文来自Cancer，DOI: 10.1126/science.aaw9872，喜欢的朋友可以自行下载，不废话，读起。
Cysteine depletion induces pancreatic tumor ferroptosis in mice。
这是一篇介绍肿瘤铁死亡的文章，高端、大气、上档次。不一定能读懂，但是，我就不想读懂。铁死亡是细胞死亡的一种形式，由脂质活性氧(ROS)的灾难性积累引起。致癌信号在许多肿瘤类型中增加脂质ROS的产生，并被来自氨基酸半胱氨酸的代谢物所抵消。说明了什么，半胱氨酸对肿瘤铁死亡具有保护作用啊。PDAC细胞使用半胱氨酸合成谷胱甘肽和辅酶A，这两种物质一起下调铁死亡。小结一下：半胱氨酸可以合成GSH和辅酶A，抑制铁死亡。也就是半胱甘酸可以促进肿瘤生长，抑制肿瘤死亡。Cancer的文章，我不能不小心仔细啊。那么半胱氨酸怎么来的呢，是通过一个叫Xc-的系统输入的（我也不懂，一看就高大上）。科普一下，半胱氨酸是非必需氨基酸，可以自己合成的。如何模拟肿瘤在体内的环境呢，转基因鼠是不是要安排一下，发现敲除Xc-系统中的一个亚单元SLc7a11就可以诱导肿瘤铁死亡，当然也可以用半胱氨酸（胱氨酸）酶来复制出同样的效果。（讲的好有道理，我竟然无言以对）。众所周知，KRAS突变是胰腺癌最常见的突变形式，突变后的KRAS介导了一系列的生物过程，包括增殖、侵袭、代谢改变等。其中ROS就是KRAS介导诸多生物学过程所产生的废物，肿瘤组织如何将其代谢出去避免集聚引起肿瘤氧超载死亡的呢？这里不得不说体内的活性氧代谢，一般都是还原成分如GSH将活性氧转化为非活性形式进行代谢。
这里是不是可以插入一段什么是活性氧及代谢的简介啊，安排一下：活性氧（ROS）是含氧的化学反应性化学物质。实例包括过氧化物，超氧化物，羟基自由基，单线态氧，和α-氧。在生物学背景下，ROS形成为氧的正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。然而，在环境压力（例如，紫外线或热暴露）期间，ROS水平会急剧增加。这可能会对细胞结构造成严重损害，这被称为氧化应激。ROS的产生受植物中应激因子反应的强烈影响，这些增加ROS产生的因素包括干旱，盐度，寒冷，营养缺乏，金属毒性和UV-B辐射。ROS也由外源性源如电离辐射产生。在机体内，ROS的主要来源之一是线粒体内膜的呼吸链底物端，在线粒体中的电子传递链复合物将电子传递给O2的过程中，有一部分O2被还原，形成O2-或H2O2。其中，最为重要的是O2-，它是大部分的ROS的前体，主要由线粒体内膜呼吸链中的蛋白酶复合体Ⅰ、Ⅲ产生。这部分作为代谢副产物的ROS长期被当作损伤生物大分子的毒性分子，但近年来被认为在较低水平时作为一类信号小分子具有生理作用，另一个ROS的重要来源是NADPH化酶，其催化亚基被称为NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能够在细胞质膜上表达。在不同的组织中已经鉴定了6种NOX-2的同源物：NOX1，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1和DUOX2，统称为NOX家族蛋白。这些酶能通过质传递电子产生ROS，可以大量存在于吞噬细胞，也在其他各种组织细胞中以较低水平普遍存在，参与很多膜受体下游信号激活。
正常时，约2%的氧参与活性氧的产生；生理条件下，适量的活性氧可促进免疫、修复、存活、生长等。消除活性氧的抗氧化体系分为酶系和非酶系，酶系有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等，非酶系主要是还原型谷胱甘肽（GSH）、维生素C/E等。细胞内高水平谷胱甘肽GSH，CAT（H2O2酶）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶SOD、环孢素、抗凋亡因子Bcl-2，可下调活性氧的产生水平。以亚铁血红素过氧化物酶/辣根过氧化物酶催化H2O2氧化荧光物、产生荧光素的荧光法，特异性和灵敏度较高;通过测定活性氧损伤的产物如脂质过氧化物（oxLDL）和DNA损伤产物（8-羟基鸟嘌呤）等，可间接反映活性氧产量。
线粒体是过量的活性氧主要的促调亡靶，可诱导线粒体双层膜通透孔（PT孔）开放，释放钙离子、细胞色素C、凋亡诱导因子AIF，引起胱冬蛋白酶caspase9激活caspase3/6/7；可使线粒体电子传递链解耦联，下调ATP产生水平，上调促凋亡蛋白Bax的表达水平，最后使线粒体外膜破裂，导致细胞凋亡。活性氧在体内作用很广泛，介导的通路也很多，上个简单直观的图吧，具体感兴趣的朋友可以去检索一下。
那个半胱氨酸是怎么进入到细胞内的呢，需要Xc-系统（高大上有没有，有没有必要科普一下呢？在生理状态下Glu/胱氨酸转运体（XC-）释放一分子的Glu，摄取一分子的胱氨酸入细胞内，两者藕联转运。胱氨酸在细胞内迅速被还原为半胱氨酸，一部分参与细胞内重要自由基清除剂谷胱甘肽的合成，另一部分则出细胞氧化成胱氨酸，重新参与XC-系统循环。生化不学好，科研都做不了！！就这…………），作者在Xc-谱系缺失小鼠体内发现在正常细胞中即使Xc-系统缺失，好像对ROS集聚也没有太多作用啊，说明正常体内对半胱氨酸需求也不是那么多吗。那么，肿瘤代谢活跃，产生大量ROS ，对这个系统的需求就另说了，可能会是肿瘤治疗的一个潜在靶点。这个胱氨酸和半胱氨酸我是彻底蒙了，光是英文就容易错，一个是cystine（胱氨酸），一个是cysteine（半胱氨酸），你能知道谁是谁？感觉这个文章就是讲了半胱氨酸在肿瘤体内介导了ferroptosis过程，是不是也没这么难懂了。
首先，要看看半胱氨酸的作用，在培养基里加入不同浓度的胱氨酸或者Xc-系统抑制剂IKE看看效果怎么样。在五个PDAC株中的四个中，胱氨酸饥饿使细胞存活率降低了80%以上；这在很大程度上可以通过添加亲脂性抗氧化剂Trolox来预防。胱氨酸饥饿的细胞经历了灾难性的质膜不稳定，但是并没有发生核碎裂（作者这里有个视频）
panc-1在胱氨酸饥饿中的反应，记录了处理后6-12小时变化，处理后8小时出现改变
IKE处理模仿了胱氨酸停用的效果，以一种外观上与胱氨酸饥饿相同但与星形孢子素诱导的凋亡不同的方式迅速杀死了四个敏感的PDAC株中的大多数细胞（这里作者提供的是视频）。
panc-1在加入IKE后的反应，记录处理后6-12小时变化和上图类似，这些细胞在相似的时间跨度内死于膜气球效应
星形孢子素处理PANC-1细胞6-12小时的时间推移显微镜观察。星形孢子素是一种已知的凋亡诱导剂，在此引起典型的核碎裂表型
处理16小时后的效果
这里为什么会用到星状孢子素（STN）诱导细胞凋亡我还是不理解。胱氨酸饥饿和系统Xc-抑制(统称为半胱氨酸耗竭)都不会诱导caspase3清除（caspase3是经典凋亡途径的标记物，还有caspase8、9等，给个超链接，想要学习凋亡的老师们可以看看，太复杂啊，我哭了），说明这种处理后细胞死亡并不是凋亡，而是一种活性氧超载所致的细胞死亡，别动，回顾一下细胞死亡类型（凋亡，坏死，铁死亡，其他未知的死亡方式），这里基本可以排除凋亡、坏死（坏死的时候细胞会肿胀、变大，爆炸），这要不是铁死亡那作者发财了，又发现了人类未解之迷惑系列，或者可以自己再明个名什么的，作者要笑醒了。先排除铁死亡再说吧。
这个vehicle是DMSO其实我觉得意思就是个对照
作者发现，去铁胺(DFO，一种铁螯合剂)、铁抑素-1(Fer1，一种铁死亡抑制剂)或N-乙酰半胱氨酸(NAC，一种半胱氨酸的细胞通透性类似物)共同处理人PDAC细胞可以显著减少半胱氨酸耗竭引起的细胞死亡，而凋亡或坏死的抑制剂对细胞死亡的影响很小。
ZVAD凋亡抑制剂,Nec1s坏死抑制剂,BA1自噬抑制剂
这里感觉凋亡那一块是个飞地啊，但是铁坏死相关的确实有作用
可以看出不同细胞对自噬的作用还是不一样的，别动，那和铁死亡、铁自噬有什么关联？（我觉得可能这个阶段铁自噬是对细胞铁死亡起到作用的，通过增强铁自噬促进肿瘤死亡）；使用荧光探针C11-BODIPY，我们观察到半胱氨酸耗竭后细胞死亡前脂质氧化(铁死亡的一个标志)的大量增加；这可以通过Trolox、Fer-1、NAC和DFO的共同处理来抵消。
绿色是探针标记的ROS,红色是未标记的未氧化的脂质，别问我什么是PE，我不懂
6-8小时培养结果：流式细胞术分析Aspc-1细胞的染色情况(C11-BODIPY是脂质氧化的标志)，H2-DCFDA是氧化应激的标志
这个是应激水平的定量分析结果，没看到明显差异啊（每一条表示四个细胞系做三次取均值）
上图B反应的应该是在胱氨酸饥饿过程中脂质过氧化增强了，加入脂质过氧化抑制剂Tro可以阻断这个过程，但是并没有改善细胞的应激状态。从这些实验中得出结论，大多数PDAC细胞系依赖半胱氨酸来防止铁死亡。那么Xc-系统呢？下面是数据库信息挖掘，一波分析走起，对SLC7A11在人类数据集的表达分析显示，与正常组织相比，PDAC中有适度的过度表达，PDAC中过表达，并且与氧化还原应激的特征有关。
左数据库定量分析结果，右面用的是META分析，我看不懂，总之是SLC77A11有差异，且是危险因素。
还是META分析，我不懂。
然后作者又去TCGA上挖数据了，我的天，在PDAC上皮和间质中表达存在差异，发现在多数肿瘤中SLC7A11也高表达，而且在部分肿瘤中与低生存相关。
想要高大上，转基因工程鼠缺不了，而且还是双重重组基因工程策略（这是什么玩意儿，不懂，就是很高端的感觉）KrasFSF.G12D/+；Tp53R172H/+；Pdx1FlpOtg/+；Slc7a11F1/F1；Rosa26CreERT2/+(KPFSR)小鼠（懂得人来解释解释这是什么意思 ）。这个和自发成瘤的KPC鼠还是不太一样，需要条件诱导，是以一种Flpo依赖的方式出现KRAS及TP53突变，诱导胰腺癌自发发生的。说是基因型及表型和KPC鼠是一样的。但是，他莫昔芬通过rosa26位点表达的Cre重组酶的作用诱导SLc7a11的全身性缺失。这是一种什么神仙设计。原来Rosa26中设计的是一种条件表达基因，表达的是重组酶，重组酶的作用位点是Slc7a11，直接切除了靶基因。excellent。感觉有点画蛇添足的感觉，为什么不直接把Slc7a11设计成条件表达基因，还有绕一个弯呢？原因只有一个，有钱，任性。
最后的表型就是这个
然后，作者开始又验证了这个KPFSR鼠的成瘤和重组效率怎么样了（一脸问号），我看不懂了，反正很高大上，给你们图，能看懂的自己看吧。
(A) Representative KPFSR tumor stained with hematoxylin and eosin (H&E).Desmoplastic stroma is stained in pink while nuclei are stained in purple. Scale bar is 50 µm. Arrows indicate malignantepithelial structure (E) versus the stromal component (S). (B) Representative precursor lesions from KPFSR pancreasstained with H&E. Arrows highlight a normal acinus (Ac), acinar-to-ductal metaplasia (ADM),and an early panreaticintraepithelial neoplasia (PanIN). Scale bar is 50 µm. (C) Left panel: Dilution series of mixtures of completelyrecombined DNA to unrecombined DNA, in the indicated ratios. Note preferential detection of recombined allele, withdetection of only a faint unrecombined band in the 4:6 lane. Unrecombined, 1285bp; Recombined, 450bp. Middlepanel: PCR analysis of DNA recombination in tissues (liver, Lvr; spleen, Spln; kidney, Kdny) from SR mice treated withtamoxifen. Right panel: recombination as detected by PCR in KPFSR tumors treated for 6 days with tamoxifen.
我还能读，我还要读，朕的江山，朕的子民啊！当那个转基因鼠肿瘤长到4-7mm的时候，给予6天他莫昔芬和vesicle处理，然后通过超声观察肿瘤生长情况。然后就发现了在KPFSR小鼠已建立的肿瘤中，slc7a11的缺失几乎是给予vesicle治疗的中位生存期的两倍。在重组组大部分肿瘤呈现出了生长停止或者生长减缓，其中有一例居然消退了，但是vesicle组没有发现这种表现。即使补充了半胱氨酸类似物NAC也没有改变什么。彰显了Slc7a11的作用。
D图是实验开始时各组肿瘤，肿瘤不仅没了，还变成负的了，这是怎么了肿瘤君！！
一只小鼠的肿瘤消退了，看看超声结果，我觉得活检更合适啊。
在尸检，通过PCR/WB发现escaped tumor中显示出 incomplete Slc7a11 recombination，显示出非重组肿瘤细胞的生长。
(B) PCR analysis of recombination in endpoint tumors from randomizedsurvival study. Results indicate > 60% recombination of Slc7a11 in endpoint samples (See Fig S6). (C) Western blot ofSlc7a11 in endpoint tumor samples show limited changes in protein levels in control or tamoxifen treated groups.Controls are wildtype (WT) mouse embyronic fibroblasts (MEFs) and knockout (KO) MEFs generated from ourconditional Slc7a11 allele.
Cancer果然不一样，不行了，我要倒下了，今天到此为止，预知后事如何，且听下回分解。欢迎批评、指正。
