MiXCR是一个通用的框架，处理从原始测序数据到定量clonotype的免疫组数据。

支持PE和SE的reads，考虑测序质量，纠正PCR错误，还能识别生殖系高突变。

支持部分和全长分析，并使用所有可用的RNA或DNA信息，包括V基因片段上游和J基因片段下游的序列。

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下载安装地址： https://github.com/milaboratory/mixcr

发表的文献： https://github.com/milaboratory/mixcr/blob/develop/doc/paper/paperAttachments.md

mixcr官方说明文档： https://mixcr.readthedocs.io/en/master/quickstart.html

官方给的使用教程已经非常详细了。

简单的说，数据分为两类：1是多重PCR数据，2是RNA-Seq数据。针对这两种不同的数据类型有不同的分析方法：

（一）PCR数据，用amplicon参数

mixcr analyze amplicon \
    -s hsa \
    --starting-material dna \
    --5-end v-primers --3-end c-primers  \
    --adapters adapters-present \
  raw/ERR3445170_1.fastq.gz raw/ERR3445170_2.fastq.gz ERR3445170

（二）RNA-Seq方法，

用的是 shotgun参数，然后设置一下 align的参数，assemble参数这里没有设置。

mixcr analyze shotgun 
  --align "-OsaveOriginalReads=true" 
--species hs 
--starting-material rna 
--receptor-type tcr 
-r E16_R2.report（运行报告）
result/E16_R2.fq.gz（你的数据）  E16_R2.mixcr.out（前缀）

参数说明：

--align 设置了align的一个参数就是要保存reads信息。

--species 物种名hs表示人；mus表示小鼠

--starting-material 是什么类型的数据

--receptor-type tcr或者IG

-r 报告名

直接跟原始数据。PE的也可以。

最后一个是输出文件的前缀

如果需要知道每个clonotype所属reads，则可以用以下命令：

输出reads，输入文件为第一步生成的clna文件，和一个输出文件的前缀名（可以加路径，否则结果输出到当前目录，生成的fastq非常多，需要注意！)

mixcr exportReadsForClones -s E16_R2.mixcr.out.clna E16_R2.

mixcr 使用imgt library

只需要增加--library 为imgt，并且下载imgt的json文件放到 mixcr 安装目录下的library中即可。

mixcr analyze shotgun \

--library imgt \

--align "-OsaveOriginalReads=true" \

--species mmu -t 50 --receptor-type tcr \

--starting-material rna -r xxx.report \

./data/235_S1_L001_R1_001.fastq ./data/235_S1_L001_R2_001.fastq \

235_S1.mixcr.out.analyze.shotgun

输出fastq reads到指定目录：

mixcr exportReadsForClones -s G358E2L1.mixcr.out.clna mydir/myprefix.

输入一个clna文件，mydir为结果目录，必须提取创建好。myprefix为结果文件的前缀。

报错报错收集：

• OutOfMemoryError

image.png

这个报错是Assembing这一步的时候，线程数太多，如果你的机器没有那么多线程，并且你还同时跑了好几个，那么就有可能报这个错。

修正方法：
--assemble "-t 5"。同时建议不要多个mixcr同时跑，除非你有大集群。

mixcr analyze shotgun --align "-OsaveOriginalReads=true" --species hs --starting-material rna --receptor-type tcr --assemble "-t 5" -r E16_R2.report（运行报告） result/E16_R2.fq.gz（你的数据）  E16_R2.mixcr.out（前缀）

Java heap space

这种报错也会出现在sorting 过程中，我的做法是设置内存参数： mixcr -Xmx32G -Xms32G analyze

image.png

更换新版本的mixcr，更换了最新版mixcr-3.0.13，重跑不再报错。

mixcr-3.0.13 结果不再生产.clna 文件，而是.clns文件。（如何才能生成）

mixcr 2.0 软件使用：

第一步：
mixcr align --species hsa --save-description All7Samples_R1.p1.fq All7Samples_R1_align.vdjca
# -s 或--species 物种名 必要参数 hs，hsa，mus

# 第二步：
mixcr assemble --index indexFile_R1 All7Samples_R1_align.vdjca All7Samples_R1_clones.clns
# 这里--index 是为了后面输出reads而设置的。

# 第三步：输出已下参数中的信息。
mixcr exportClones --chains TRA -cloneID -count -vGene -jGene -nFeature CDR3 -aaFeature CDR3 -qFeature CDR3 All7Samples_R1_clones.clns All7Samples_R1_clones_Important.txt

# 第四步：输出reads 
mixcr exportAlignments -cloneId indexFile_R1 -descrR1 All7Samples_R1_align.vdjca All7Samples_A_alignments.txt

用法相当简单。

mixcr结果的一些下游分析才是最终要的，比如：

1，统计clonetype 的数量，以及多少reads数支持。
2，统计每个细胞中有多少分子，即每个clonotype有多少umi。
3，统计有多少个细胞，即有多少个TRA和TRB pairs。
4，统计乱七八糟事。
5，两个样品间的上述比较。可以用vdjtools： 【J】vdjtools处理mixcr数据实战

这些都是个性化分析，已经写好了脚本