纤维/缺氧/糖酵解预测模型为头颈癌患者提供更好的预后风险评估
Investigation of an FGFR-Signaling-Related Prognostic Model and Immune Landscape in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
头颈部鳞状细胞癌中与FGFR信号相关的预后模型和免疫景观研究
发表期刊：Front Cell Dev Biol
发表日期：2022 Feb 14
影响因子：6.081
DOI: 10.3389/fcell.2021.801715
一、研究背景
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）在世界范围内的发病率每年超过60万例，包括一组异质性的肿瘤，产生于口腔、口咽、喉、下咽、鼻咽和鼻窦腔。
成纤维细胞生长因子受体（FGFR）是一种受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路，参与调节肿瘤的血管生成、侵袭和转移。它被认为是纤维化发展的一个促进因素，引起肝脏纤维化的加剧，系统性硬化（SS），特发性肺纤维化（IPF）等。
缺氧作为肿瘤的一个标志，是一个强有力的微环境因素，促进各种癌症的增殖和进展。以前的研究表明，缺氧的HNSCC细胞触发糖酵解以获得能量，平衡代谢和生物能量。此外，激活的成纤维细胞合成了过多的胶原蛋白，导致了缺氧的微环境，这可能会恶化疾病的进展。
二、材料与方法
1、数据来源
1） TCGA：483名HNSCC患者
2） GEO：RNA-seq数据和相关的临床病理数据（GSE41613），包括97名HPV阴性口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者；一个单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE139324）被用于分析HNSCC患者的肿瘤免疫浸润，包括来自18个HNSCC患者的肿瘤浸润免疫细胞和来自5个健康供体扁桃体的组织常驻免疫细胞
2、分析流程
流程图
三、实验结果
01 - HNSCC中的纤维化信号和与纤维化相关的DEGs
从TCGA数据库下载的发现队列中包含483名HNSCC患者的表达谱和临床信息。70个与FGFR信号通路正相关的基因被用来评估患者的纤维化信号激活状况。基于UMAP算法，作者利用纤维化相关的表达矩阵将患者分为两个群组，能够将每个患者分配到最近的群组（图2A）。KM图表明，两个簇之间生存期存在显著差异（图2B）。分别有309名和176名患者被纳入群组1和2。
为了获得纤维化相关的DEGs，比较了两个集群之间的表达谱。共有187个纤维化相关的DEGs在集群1中过度表达，其中患者的生存率较低，这些DEGs富集在 "对创伤的反应"（图2C）和 "TGF-beta信号通路"（图2D）。这意味着群集1中的患者处于较高的纤维化激活状态。富集分析显示，群集2中过量表达的186个DEGs富集在 "免疫球蛋白复合物"（图2E）、"异生物细胞色素P450的代谢"（图2F）。这些发现与以前的研究一致，即免疫状态好的患者预后更好。
图2 根据FGFR信号通路对患者进行分组
02 - HNSCC的缺氧状态、糖酵解状态和缺氧-糖酵解相关的DEGs
利用 "GSVA "软件包，实施ssGSEA算法，量化每个HNSCC患者在MSigDB中的缺氧或糖酵解标志基因的富集分数。为了确定缺氧和糖酵解对预后的影响，进一步在患者的缺氧和糖酵解得分中进行单变量Cox回归分析。如图3A的森林图所示，低氧和糖酵解被认为是HNSCC患者预后的危险因素。基于最大选择的秩统计，根据缺氧（图3B）和糖酵解（图3C）得分将患者分为两组。进一步将缺氧和糖酵解状态综合为一个二维指数，将患者分为三组，即缺氧高/糖酵解高、缺氧低/糖酵解低和"混合 "组。三组之间的存活率有明显的差异（图3D）。生存分析（KM）显示，低氧/高糖组的存活率高于低氧/低糖组（图3E）。除此之外，混合组处于一个中间水平。在比较低氧/低糖和低氧/低糖之间的表达谱后，共得到108个低氧-糖酵解相关的DEGs。
图3 根据患者的缺氧和糖酵解状态进行分组
03 - 在TCGA数据集中构建纤维化-缺氧-糖酵解相关的预后模型
将上述从HNSCC中筛选出的334个纤维化相关和108个缺氧-糖酵解相关的DEGs取交集，得到39个共有基因（图4A）。为了进一步筛选出预后性DEGs，对39个DEGs进行单变量Cox回归分析，发现21个P<0.05的DEGs（图4B）。其中，大部分是风险DEGs。用LASSO回归方法从上述21个预后DEGs中选出6个关键变量，其中4个是风险DEGs，2个是保护性的（图4C,D）。对于每个HNSCC患者，根据6个特征性DEGs的表达水平和LASSO Cox回归的相应系数计算出风险分数：风险分数=0.0369 × AREG的表达+ 0.03432 × THBS1的表达+ 0.02182 × SEMA3C的表达+ 0.07125 × ANO1的表达+（-0.07718）× IGHG2的表达+（-0.09177）× EPHX3的表达。使用最大选择等级法作为划分依据，根据风险评分将患者分为高风险组和低风险组（图4E）。与高危组相比，低危组对预后的影响明显更好（图4F）。
图4 构建HNSCC患者的预后生存模型
作者对483名HNSCC患者进行了生存分析，根据原发肿瘤的位置进行重组，试图验证预后模型的可靠性。在几个HNSCC高发区，如舌头和喉部（图5B,D），生存期比较显示，高危组与患者的预后较差有关。扁桃体、下咽等也是如此（图5A,C）。单变量Cox回归分析表明，风险评分与其他临床特征（如年龄）相似，可被视为评估HNSCC患者预后的一个独立风险因素（图5E）。此外，ssGSEA被用来估计患者的免疫细胞浸润情况。为了探索预后模型和免疫细胞浸润之间的相关性，对六个最佳预后特征和免疫细胞浸润评分进行了相关分析（图5F）。此外，与低风险组相比，在高风险组中观察到八种特定的免疫细胞浸润明显减少，即活化的B细胞、未成熟的B细胞、活化的CD4 T细胞、活化的CD8 T细胞、效应记忆CD8 T细胞、MDSCs和肥大细胞（图5G）。
图5
基于纤维化-缺氧-糖酵解的预后模型在一个独立队列 "GSE41613 "中得到进一步验证。在97名OSCC患者的表达矩阵中搜索预后模型中的6个基因，发现了其中的5个基因。单变量Cox回归分析证实，AREG、THBS1、SEMA3C和ANO1是患者预后的危险因素。相反，EPHX3是一个保护性的，这与之前进行的模型一致（图6A）。根据最大选择等级统计，根据每个基因的表达水平将患者分为两组（图6B,D,F,H,J），并进行生存分析（图6C,E,G,I,K）。KM曲线显示，预后模型中四个风险基因表达水平较高的患者OS较差（图6C,E,G,I），而保护基因则相反（图6K）。
图6 在外部数据集中进行验证（GSE416130）
04 - 预后标志物的IHC分析
为了进一步验证预后相关分子在HNSCC标本和头颈部正常鳞状上皮的表达，作者对HNSCC的石蜡切片进行了IHC染色分析。IHC染色分析表明，通过抗体ab135842（图7A-F）和ab134050（图8A-F）的量化，SEMA3C和IGHG2在HNSCC组织中的表达略高。
根据HPA的蛋白表达数据，比较了HNSCC组织和正常位于头颈部的鳞状上皮（如口腔鳞状上皮）中六个基因签名的蛋白表达。初步推断，这些基因的蛋白表达在HNSCC和正常组织之间存在差异。
图7 SEMA3C在HNSCC和正常组织中的蛋白表达的IHC分析
图8 HNSCC和正常组织中IGHG2的蛋白表达的IHC分析
05 - 基于scRNA-Seq的HNSCC患者的纤维化相关的免疫景观
为了进一步了解纤维化信号和免疫之间的相关性，作者分析了从GEO数据集 "GSE139324 "下载的scRNA-seq数据。共有23个样本被用于分析。其中，18个样本是来自HNSCC患者（HPV阴性）的肿瘤浸润免疫细胞，5个是来自健康供体扁桃体的组织驻留免疫细胞。在用和谐算法整合数据和用t-SNE算法进行分档后，20个细胞集群被成功分类。此外，HNSCC患者和健康供体（HD）之间每个细胞亚群的数量都有明显的差异（图9A）。通过几个细胞表面和细胞内标志物的表达，集群4和11被定义为单核细胞。群组3、9、13、14和20表达了与B细胞相关的标记（如CD79A），其余的群组表达了与T细胞相关的基因（如CD3D）（图9B）。在图9C,D中，低存活率患者中高表达FGF-受体信号相关基因的细胞和高表达的DEGs被严重强调，其中大部分在集群4和11中高表达。与健康对照组相比，患者中的单核细胞组成明显较高（图9E）。在HNSCC和HD之间，第4和第11群的细胞数量有明显的差异（图9F,G）。点阵图的热图意味着所提到的基因在单核细胞中比在其他种类的免疫细胞中更富集（图9H）。
图9
四、结论
FGFR信号、缺氧和糖酵解的状态与HNSCC患者的预后相关。上述的预后模型可能为预后预测和个体化治疗提供潜在的应用价值。
