安装orthofinder     使用conda安装

安装软件前，先设置一个小环境，不要直接在自己账户的当前环境内安装软件；你可以创建很多小环境名，有的小环境坏了，你不要就可以了，就好比柜子坏了，你可以扔了，但是如果你把自己账户环境折腾坏了，好比储藏室被你搞坏了，那恢复的代价就高了.

执行命令：conda create-n orthofinder orthofinder=2.5.4     #最新是orthofinder=2.5.4版本

安装完成后，执行命令：conda activate orthofinder      #To activate this environment

相对应的为： conda deactivate         # To deactivate an active environment

要是想查看查看已经存在小环境名：

conda info -e

conda info --envs

conda env list

这三个命令都可以。

# conda environments:     以下是我目前所有的环境

base                  *  /home/dreamer/anaconda3

orthofinder              /home/dreamer/anaconda3/envs/orthofinder

pfam_scan                /home/dreamer/anaconda3/envs/pfam_scan

之后检测是否安装成功，执行命令：orthofinder -h    #test run orthofinder注意一定要在orthofinder这个文件夹在执行，不然容易出错。

运行orthofinder

#用miniconda安装的orthofinder找不到示例文件，就直接下载orthofinder包，然后将里头的ExampleData复制到服务器里的orthofinder文件里。

#运行orthofinder：orthofinder -f ExampleData/ -S diamond -M msa -T raxml -t 8

①参数介绍及选择

orthofinder -f Dataset -M msa -S diamond -T iqtree -t 24 -a 24 > orthofinder.log &

（注：&  表示任务在后台执行，如要在后台运行redis-server,则有  redis-server &）

orthofinder参数详情：

-t 并行序列搜索线程数（默认= 16）

-a 并行分析线程数（默认值= 1）

-M 基因树推断方法。可选：dendroblast和msa（默认= dendroblast）推荐msa

-S 序列搜索程序（默认= blast）选项：blast，mmseqs,，blast_gz，diamond（推荐使用diamond，比对速度很给力）

-A 多序列联配方式，需要添加参数-M msa时才有效；（默认= mafft）可选择：muscle，mafft

-T 建树方法，需要添加参数-M msa时才有效，（默认 = fasttree）可选：iqtree，raxml-ng，fasttree，raxml（推荐）

-s <文件> 可指定特定的根物种树

-I 设定MCL的通胀参数（默认 = 1.5）

-x Info用于以othoXML格式输出结果

-p 将临时pickle文件写入到

-l 只执行单向序列搜索

-n 名称以附加到结果目录

-h 打印帮助文本

如果只需要查找直系同源基因，只需接“-f” 参数即可；此步也可建树，采用默认的建树方法fasttree，为无根树。

nohup orthofinder -f Dataset &      (注：nohup 英文全称 no hang up（不挂起），用于在系统后台不挂断地运行命令，退出终端不会影响程序的运行。)

如果添加-M msa -T iqtree设定制定参数，可按照设定的参数使用最大似然法构建有根的物种进化树，构建的树为STAG树。

nohup orthofinder -f Dataset -M msa -S diamond -T iqtree -t 24 -a 24 2> orthofinder.log &

关于构建系统进化树，有很多种做法，常见的有利用物种全部的蛋白序列，构建STAG物种树；也有使用单拷贝直系同源基因构建的物种进化树，关于这一点，OrthoFinder查找同源基因，可以输出直系单拷贝同源基因的序列结果，后续也可使用其他构树软件及算法进行进化树构建。关于建树方法，则有距离矩阵法、最大简约法、最大似然法以及贝叶斯；当然目前主流采用的基本为最大似然法和贝叶斯，其中贝叶斯算法计算量巨大，耗时最久，其构建的树也认为最为“逼真”，但文章中使用较多的还是最大似然法，其耗时也需蛮久。

正式运行Orthofinder，相当简单的操作,-f输入目录，里面包含你需要运行的蛋白质fasta文件， -t 所用到的CPU数目。基本的用法就如下，更多的可以去manual中查看。

orthofinder -f Mycoplasma/ -t 2

orthofinder的参数写的很详细，自己查看选择即可。其中有个说明就是在比对和建树是的e值和bootstrap的设置，可以在anaconda/bin/config.json下修改相应程序的参数，添加e值和bootstrap的值。

高级用法：

通过上面的参数，我们可以做一个从蛋白序列到同源基因建树的流程，但是仍然有一些参数无法设置，比如建树过程中的bootstrap。这时候，我们就要修改程序的config.json文件。

如果你是用anaconda安装的orthofinder，那么config.json文件在：anaconda2/bin/config.json

文件开头介绍了修改方法，你可以添加任何你想在流程中使用的软件，只要按照其格式进行命令修改就行。这里主要说一下对其中缘由参数的修改。

如要修改比对过程中的E-value值，那么在相应比对命令里修改数值，blast_gz 里的 -evalue ，diamond 里的 -e 。

如要在iqtree建树过程中增加bootstrap， 则在iqtree的"cmd_line":中添加

-bb 1000 （iqtree的超快bootstrap）或  -b 1000（传统bootstrap）

raxml-ng类似，你可以添加任何你想修改的参数，大家可以在熟悉各软件的的参数后，根据自己的需求更改。

orthofinder -f path/ -S diamond -M msa -T raxml -t 8

# 1. -f 存放你要比对的物种的蛋白序列路径

# 2. -S 比对方法，如果不想等很久的话就diamond吧，毕竟是软件的亮点之一。比对速度是blastp很多倍，结果也差不多。

# 3. -M msa 基因树推断方法

# 4. -T 建树方式，这里选择raxml

# 5. -t 序列搜索线程数，考虑到提交到集群，所以直接用了8个线程

将多个物种的蛋白序列放入data 文件夹下

结果解读：

运行结束后，会在ExampleData里多出一个文件夹，Results_Feb14, 其中Feb14是我运行的日期

生成的结果会存储于Orthofinder/Results_XXX文件中，现在简单看看里面有啥。

我们主要使用Orthoogroups查看正交群的基因和使用 Single_Copy_Orthologue_Sequences里的单拷贝基因构建系统发育树。

直系同源组相关结果文件，将不同的直系同源基因进行分组

Orthogroups.csv：用制表符分隔的文件，每一行是直系同源基因组对应的基因。

Orthogroups.txt: 类似于Orthogroups.csv，只不过是OrhtoMCL的输出格式

Orthogroups_UnassignedGenes.csv: 格式同Orthogroups.csv，只不过是物种特异性的基因

Orthogroups.GeneCount.csv：格式同Orthogroups.csv, 只不过不再是基因名信息，而是以基因数。

直系同源相关文件，分析每个直系同源基因组里的直系同源基因之间关系，结果会在Orthologues_Feb14文件夹下，其中Feb14是日期

Gene_Trees: 每个直系同源基因基因组里的基因树

Recon_Gene_Trees：使用OrthoFinder duplication-loss coalescent 模型进行发育树推断

Potential_Rooted_Species_Trees: 可能的有根物种树

SpeciesTree_rooted.txt: 从所有包含STAG支持的直系同源组推断的STAG物种树

SpeciesTree_rooted_node_labels.txt:  同上，只不过多了一个标签信息，用于解释基因重复数据。

比较基因组学的相关结果文件：

Orthogroups_SpeciesOverlaps.csv： 不同物种间的同源基因的交集

SingleCopyOrthogroups.txt： 单基因拷贝组的编号

Statistics_Overall.csv：总体统计信息

Statistics_PerSpecies.csv：分物种统计信息

STAG是一种从所有基因推测物种树的算法，不同于使用单拷贝的直系同源基因进行进化树构建。