2种建库方法，分别是Clontech公司推出的SMART法和EpiCentre公司推出的TargetAmp方法。

单细胞mRNA测序

2个难题

第一个难题：PCR偏差

• PCR偏差，就是在PCR扩增过程当中，某些片段被大量扩增。
• 而大部分片段被扩增的量很少，甚至根本就没有被扩增。

第二个难题：去除核糖体RNA

• rRNA在总RNA当中占了95%，而mRNA在总RNA当中只占2~3%的比例。

SMART法

• SMART方法的全称是Switching Mechanism at 5’ End of RNA Template
• SMART方法最核心的技术，就是设计了2个特殊的引物。再配合用MMLV逆转录酶进行逆转录。

过程

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• 逆转录的起始引物

  
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  保证了逆转录的起始位置正好是mRNA的3’端的序列终止位置

• MMLV逆转录酶在转录到mRNA的5’端末端的时侯，会在新合成的cDNA的3’末端，多加出几个C碱基来。
  

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• 上游引物特点：3’端是3个非脱氧的G碱基，也就是核糖核酸的、RNA的G碱基，而不是DNA的G碱基

  
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• 之后就是常规的建库即可

效果

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法的巧妙点

• （1）引物：保证逆转录的位置，合成出来的cDNA之后连上通用引物
• （2）酶：利用MMLV逆转录酶加C碱基的作用，再用有3个碱基的上游引物进行第二链的合成，保证了只有完整的第一链cDNA才能被合成出cDNA的第二链，保证了双链cDNA是全长的；
• （3）保证PCR扩增的一致性，因为cDNA的5’和3’都引入了一样的引物，从而保证了PCR扩增效率的一致性。

TargetAmp法

TargetAmp的原理图

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过程

• 逆转录：用T7-Oligo(dT)的引物进行cDNA合成
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• RNase H酶把cDNA:RNA双链产物中的这个RNA链消化掉

  
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• 转录：利用链上的T7启动子，转录出大量的反义RNA来（antisense-RNA，aRNA）
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• 纯化反义RNA
• 逆转录：随机引物进行逆转录，得到第二轮的cDNA
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• 再用T7-Oligo(dT)这个引物，粘到第二轮的cDNA的Poly(A)尾巴上，再合成出双链DNA来。

  
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• 转录：这个双链的cDNA再经过第二轮的转录
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• 再经过一轮逆转录

巧妙之处

• 不是用PCR来扩增核酸，而是用转录的方法来增加核酸的量。因为扩增那么多（倍）的核酸，如果用PCR，要用几十个循环，那么PCR不同的扩增子的扩增效率，即使一开始是很小的差异，也会在几十个循环中，被指数放大，变成一个很大的差异。
• 统一都用T7这个统一的启动子，它转录的启始效率，大体上就保持了一致。

应用

• 循环肿瘤细胞研究
• 胚胎发育研究
• 神经活动研究