【生信知识】---MinION纳米孔测序技术详解
前言：第三代测序技术正在逐渐成熟。目前的测序读长可达150kbp左右。Nanopore公司的MinION测序仪，优势在于测序读长长，测序速度快，设备小巧而广受欢迎。
1.MinION测序技术简介
MinION纳米孔测序仪的核心是一个有2,048个纳米孔，分成512组，由专用集成电路控制的flow cell。测序原理见图1a所示：首先，将双分子DNA连接lead adaptor（蓝色），hairpin adaptor（红色）和trailing adaptor（棕色）；当测序开始，lead adaptor带领测序分子进入由酶控制的纳米孔，lead adaptor后是template read（即待测序的DNA分子）通过纳米孔，hairpin adaptor的作用是DNA双链测序的保证，然后complement read（待测序分子的互补链）通过纳米孔，最后是trailing adaptor通过。在上述测序方法中，template read和complement read依次通过纳米孔，利用pairwise alignment，它们组合成2D read；而在另外一种测序方法中，不使用hairpin adaptor，只测序template read，最终形成1D read。后一种测序方法通量更高，但是测序准确性低于2D read。每个接头序列（adaptor）通过纳米孔引起的电流变化不同（图1c），这种差别可以用来做碱基识别。
图1 MinION的2D read数据产生
2.MinION测序技术应用
1）检测碱基修饰
纳米孔测序技术可以检测四种胞嘧啶（cytosine）碱基修饰，分别为5-methycytosine，5-hydroxymethycytosine，5-formylcytosine和5-carboxylcytosine。检测准确率为92%-98%。
2）实时测序监控
对于临床实践，实时获取和分析DNA/RNA序列是一件很重要的事情。对于传统的NGS测序，做到这一点非常不易。但对于MinION，实现起来相对容易。这不仅是因为MinION体积小，易操作等，更是因为在测序过程中单分子穿过纳米孔，其电流变化可以检测并识别，这种设计允许用户在测序过程中根据实时结果做出一些判断。实时测序监控对于MinION针对特定目标序列测序有重要的应用（图2）：当DNA片段通过纳米孔时，如果电流变化呈现与目标序列一样的趋势，则通过纳米孔。如果DNA片段与目标序列呈现不同的电流变化趋势，则不能通过纳米孔。通过这样的方式，实现目标序列的富集，从而显著减少测序时间，对于在野外和即时诊疗有重要意义。
图2 “Read Until”策略筛选双链DNA分子
3）结构变异的检测
NGS的短序列特征使结构变异的检测往往不准确。这个问题在癌症的检测中尤其严重，这是因为癌症组织中充斥各种结构变异。研究人员发现利用MinION测得的几百个拷贝的长read得到的结构变异结果比NGS平台测得的上百万read得到的结果更可靠。
4）RNA表达分析
对于RNA表达分析，NGS平台测得的短序列带来的问题是序列需要进行拼接，才能得到转录本。这给可变剪切研究带来困扰。因为通常情况下NGS测序不能产生足够的信息将不同形式的可变剪切区分开来。而利用MinION测序仪产生的长read，可以更好地解决这个问题。研究人员利用果蝇的Dscam1基因为例，其存在18,612种可变剪切形式，利用MinION测序仪可以检测到超过7,000种可变剪切形式，而这样的结果利用NGS的短序列测序是不能够获得的。
3.生物信息学配套软件
近些年来，随着生物信息分析方法的发展，MinION测序reads成功比对参考基因组的比例已经从66%提升至92%。文章下面对各种工具的适用场景进行了分别介绍。工具概述见表1。
表1 MinION测序数据分析工具
1）碱基识别工具
Metrichor是ONT公司推出的基于隐马尔可夫模型进行碱基识别的软件。它的使用需要网络连接。MinION注册用户需要获得开发者账号才能获得软件的源代码。2016年初，两个实验室分别开发了Nanocall和DeepNano软件。这两个软件都可以在本地运行，不需要网络连接。Nanocall基于隐马尔可夫模型，可对1D read在本地进行碱基识别；DeepNano基于recurrent neural network framework，可以获得比隐马尔可夫模型更准确的碱基识别。
2）序列比对工具
传统的NGS序列比对软件不能满足MinION序列比对的需求。这是因为MinION测序数据错误率相对高且序列长，即使调整参数也不能取得好的效果。在这种情况下，适合MinION测序数据的比对软件应运而生。
MarginAlign是通过更好地估计MinION测序reads测序错误来源从而提高与参考基因组的比对效率。通过评估检测到的变异，发现其显著提高了比对的准确性。由于MarginAlign是基于LAST或BWA mem的比对结果进行优化，结果的最终准确性依赖最初的比对结果。
GraphMap是另一个用于MinION测序数据比对的软件。它利用的是一种启发式（heuristics）方法，对高错误率reads和长reads进行了优化。一项研究表明GraphMap比对的灵敏性可与BLAST媲美，且它对reads测序错误率的估计与MarginAlign相当。
3） 从头组装工具
MinION测序数据不适合利用NGS数据组装的de Bruijn图法进行组装，主要存在两方面的原因。第一，de Bruijn图法等方法依赖测序reads拆分的k-mer测序准确，而高错误率的MinION测序reads不能保证这一点；第二，de Bruijn图的结构不适用长reads。
MinION测序数据的长reads更适合Sanger测序时期基于有overlap的共有（consensus）序列组装的方法。需要的是在组装前进行测序reads的纠错。第一个基于这种原理进行组装的研究组利用MinION数据组装了一个完整的E. coli K-12 MG1655基因组，序列准确率达到99.5%。他们利用的流程称为nanocorrect，首先利用graph- based，greedy partial order aligner方法进行纠错，然后利用Celera Assembler将纠错后的reads进行组装，最后利用nanopolish对组装结果进行进一步提升。
4）单核苷酸变异检测工具
Reference allele bias是一种在变异检测中倾向于少检测出变异的现象。该现象在测序reads错误率高的情况下尤为严重。
MarginAlign中的marginCaller模块是研究机构开发的适用于MinION测序数据的变异检测软件。MarginCaller利用maximum-likelihood参数估计和多条测序reads序列比对来检测单核苷酸变异。
当计算机模拟出测序错误为1%时，测序深度在60X，marginCaller检测出的SNV具有97%的准确率和完整度。另外一项研究中，研究者利用GraphMap方法，检测人基因组的杂合变异，可以达到96%的准确率。利用计算机模拟的数据，GraphMap同样可以高准确率，高完整度地检测出结构变异。
Nanopolish也可以用来检测变异。它用的是event-level alignment算法。在该方法中，从参考基因组序列开始，依次评估参考基因组序列产生的电信号与测序reads的相似性进而依次修饰参考基因组序列，生成一个consensus read。直到consensus read与测序read产生的电信号足够相似，将consensus read与参考基因组序列比较，得到变异。该方法在埃博拉病毒的研究中有大约80%的准确性。
PoreSeq采用与Nanopolish类似的算法。它可以利用更低深度的测序数据获得高准确率和高完整度的SNV检测。在一项研究中，PoreSeq在16X测序深度下获得99%准确率和完整度的SNV检测，与marginAlign相比，它显著降低了测序深度。
5）共有序列的测序（consensus sequencing）方法
MinION测序数据目前只有92%的准确性。在低深度测序的情况下，不能够满足类似单体型（haplotype phasing）和人样品的SNV检测的要求。文章提到的解决问题的方法是rolling circle amplication，它的原理是将一个片段进行多次扩增，在一个DNA分子上生成多个拷贝，这样最终获得的共有序列测序结果的准确率可以达到97%。
