Nat Med：一个病例带你了解单细胞测序如何指导临床治疗

2020-04-12 本文已影响0人科研菌

今天跟大家分享的是2020年1月发表在Nat. Med.（IF：30.641）杂志上的一则Letters：Targeted therapy guided by single-cell transcriptomic analysis in drug-induced hypersensitivity syndrome: a case report.在文章中作者采集了SMX-TMP诱导的DIHS/DRESS患者以及健康志愿者的样本，基于单基因组学，利用单细胞测序、t-SNE分析、免疫组化、流式细胞术等一系列方法，探讨了DIHS/DRESS的潜在相关通路和潜在靶点。

Targeted therapy guided by single-cell transcriptomic analysis in drug-induced hypersensitivity syndrome: a case report

单细胞转录组分析指导药物过敏综合征的靶向治疗：病例报告

一.研究背景

具有全身症状和嗜酸性粒细胞增多为特征的药物诱发超敏综合症/药物反应（DIHS/DRESS）是与疱疹病毒再激活及随后自身免疫疾病发作相关的潜在致命多器官炎性疾病。由于其病理生理学仍然难以捉摸，治疗选择有限。单细胞RNA测序（scRNA-seq）的进展为缺乏动物模型的的DIHS / DRESS中提供了前所未有的剖析疾病病理生理学的机会。

二.分析流程

分为探索和验证两部分：

三.结果解读

1.scRNA-seq分析显示DIHS/DRESS中存在独特的皮肤T细胞转录组

文章报告的是一位44岁男性患者由磺胺甲恶唑(SMX)和甲氧苄啶(TMP)诱导超敏综合征的病例。

图1a：展示了不同时期给予患者的药物治疗，发现当增加霉酚酸酯（MMF）而减少环孢霉素（CsA）用量时，虽然改善了皮肤炎症，但患者面临发生危及生命并发症的高风险。

作者将患者皮肤活检分离成单细胞悬浮液，并进行scRNA-seq分析（图1b）。对患者和5名健康志愿者（HV）采集的皮肤细胞样本作无监督聚类和t-SNE分析，聚类出14个cluster（图S1b）。

图1c：在每个cluster内Maker genes的表达水平。

图1d：每个cluster内DIHS/DRESS和HV细胞之间的DEGs数量投射到t-SNE图上，显示免疫细胞和非免疫细胞类型发生广泛的转录组改变，其中在淋巴细胞簇中最显著。

图S1c：比较患者和HV样本，鉴定了来源DIHS/DRESS皮肤的角化细胞和免疫细胞的相对丰度，这也在一定程度上反映了炎症状态。

图S1d：基于主要的细胞类型(如角化细胞和淋巴细胞)，将DEGs被投射到t-SNE图上，进行验证：证明淋巴细胞簇是表现出显著转录组差异的主要细胞类型。

作免疫组化分析进一步验证，上述结果与检测到的CD4和CD8+ T细胞的密集浸润一致(图S1e)，表达CD3E和CD4或CD8A的细胞在淋巴细胞簇内占优势(图S1f,g)。

接着探讨淋巴细胞簇内转录组变化的生物学意义，将DEGs进行途径富集分析。

结果显示：淋巴细胞激活和细胞因子信号通路显著富集，IL2RG、JAK3和STAT1等通路上调(图1e、f)。

参与细胞增殖(如MKI67)和迁移(如CCR10)的基因表达上调(图1e,f)。

DIHS/DRESS和HV两者表现出明显的转录组差异，进一步验证了上述基因在DIHS/DRESS显著表达(图1g和图S1h)。

免疫荧光分析结果显示在DIHS/DRESS中JAK3的显著表达(图S1i)。

此外，免疫组化染色检测到单核细胞中磷酸化的STAT1(图S1k)，表明在皮肤浸润淋巴细胞中，JAK-STAT信号通路是活跃的。

图1. scRNA-seq分析显示DIHS/DRESS中存在独特的T细胞转录组

图S1.DIHS/DRESS皮肤的T细胞浸润情况

2.DIHS/DRESS T细胞的转录组特征，以及CD4+T细胞中HHV6b DNA显著富集

接着探索是否在血液中反映类似的转录组特征，作者对患者外周血单个核细胞(PBMCs)进行了scRNA-seq检测，并与年龄和性别匹配HV的PBMCs进行了比较(图2a和图S2a,b)。

将DEGs投射到t-SNE图上，发现CD4T和CD8T淋巴细胞亚群具有显著的转录组差异(图2b)。把选定的基因投射t-SNE图上，虚线区域显示的是图2b中的显著差异的亚群,例如亚群CD4、CD8(图2c、图S2c,d)。

接着作单细胞T细胞受体(TCR)的测序，在单个T细胞水平上对配对的TCR链序列进行分析，显示了DIHS/DRESS T细胞中TCR的显著差异(图S2e,f)。

无监督分析显示，PBMC T细胞亚群中含有大量的DEGs，其特征是CCR4和CCR10的高表达，而CCR7低表达(图2c和图S2d)。

然后作流式细胞术验证DIHS/DRESS血中CCR4+CCR10+ T细胞增加(图2d，e)。

进一步比较图2b中转录组高变的亚群，发现细胞因子介导的信号和T细胞激活的通路上调(图S2i)，例如JAK3和STAT1(图2f)。

接着又对PBMCs中来源于HHV6b的DNA做了定量PCR检测(图2g)，发现来自HHV6b的DNA在CD4 +T细胞中高度富集(图2 h)。

这组结果展示了：DIHS/DRESS皮肤和血液中的T细胞显著增殖，趋化因子受体表达明显，JAK-STAT信号通路相关基因上调，HHV6b主要富集于CD4 + T细胞，具有Tcm表型。

图2.DIHS/DRESS T细胞的转录组特征，以及CD4+T细胞中HHV6b DNA显著富集

图S2.血液中DIHS/DRESS T细胞的特征

3.抑制JAK来逆转DIHS/DRESS相关转录组出现的临床进展

作者发现到DIHS/DRESS患者的JAK-STAT信号通路相关基因显著上调，所以采取了JAK抑制疗法（使用tofacitinib——JAK1和JAK3的抑制剂），用药及剂量如图3a所示。

作了流式细胞仪分析，结果显示治疗后CCR4 + CCR10 + CD4 +和CD8 + T细胞显著减少（图3b和图S3）。

接着比较了治疗前后的PBMCs，作scRNA-seq分析后，显示CCR4-、CCR10的T细胞（具有增殖特征）显著减少（图3c–e）。

停用Valganciclovir（缬更昔洛韦）后，虽然HHV6b DNA水平瞬时升高（图3f），但患者的皮肤状态仍然较好，可能是tofacitinib起到作用。

图3.抑制JAK来逆转DIHS/DRESS相关转录组出现的临床进展

图S3.tofacitinib治疗后CD8+效应记忆T细胞循环减少

4.体外实验：tofacitinib和抗病毒药物抑制了SMX-TMP诱导的T细胞增殖

作者接着使用淋巴细胞转化试验(LTT)在体外实验模拟药物诱导的免疫反应。将荧光素(CFSE)标记的DIHS/DRESS CD4 + T细胞与SMX-TMP一起培养，识别细胞增殖情况(图4a)。

作scRNA-seq 分析，来捕获转录组的变化(图4b、图S4),显示在低CCR7、高CCR10的CD4 + T细胞和单核细胞中大量差异表达的DEGs(图4c)。通过MKI67（细胞增殖标记物）的表达情况确定了cluster1是具有增殖基因特征的主要亚群(图4 c, d)。

此外，cluster1显示了STAT1和JAK-STAT信号通路下游其他基因的激活，包括CISH和SOCS3(图S4b,c)。

潜在的靶细胞因子IL13同样也上调了(图S4c)。

SMX-TMP也触发了CCR4的配体CCL17和CCL22的上调，(图S4d,e)。

与在PBMCs中的发现一致(图S2e,f)，单细胞TCR测序显示SMX-TMP刺激后没有克隆优势(图S4f)。

LTT中加入针对HLA-DR的阻断抗体完全抑制了CD4 + T细胞的增殖(图4e)。提示潜在机制：药物作为超抗原或修饰MHC，导致其与更广泛的TCRs 发生作用。

为了确定抑制JAK是否能够抑制SMX-TMP诱导的T细胞增殖，作者使用tofacitinib进行LTT。显示tofacitinib抑制CD4 + T细胞增殖(图4f)以及使JAK-STAT通路相关基因下调(图S4g-j)。

在LTT中测试了ganciclovir（更昔洛韦）以及具有抗hhv6活性的artesunate（青蒿琥酯），结果显示抑制了SMX-TMP诱导的CD4 + T细胞增殖(图4f)。

图4.体外实验：tofacitinib和抗病毒药物抑制了SMX-TMP诱导的T细胞增殖

图S4. LTT中的CD4+ T细胞和骨髓细胞转录组改变的通路分析

在DiHS/DRESS的病例中，tofacitinib的成功干预是通过scRNA-seq的使用才得以发现的。虽然该疾病的早期事件和病毒的贡献仍有待阐明，但LTT研究表明，JAK抑制和抗病毒药物都是DiHS/DRESS药物诱导阶段的有希望的靶点。这项研究仅代表了对单个患者的深入研究，其结果需要扩展到更大的患者队列。然而，这些数据表明，基于单细胞组学的方法可能是指导复杂病理生理疾病(包括其他炎症性疾病和癌症)的有力手段。

还是和往常一样，后台回复「3b」，即可获取今天小编为大家解读的文献。本期的分享就到这里啦，一起期待下一期的精彩分享吧~

编辑：碎冰冰

校审：糯米饭

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