科研文献|圈养和类人猿微生物组的共同多样化

今天小编给大家分享一篇关于“人猿”的文献，这篇文献《Captivity and the co-diversifification of great apemicrobiomes》旨在研究圈养和类人猿微生物组的共同多样化谱系。

期刊名称：natrue communications
影响因子：12.298
通讯作者：Alex H. Nishida
院校：The University of Texas at Austin
日期：2021.9.24

研究介绍

野生类人猿的肠道细菌进化枝仅限于每个宿主物种。先前的研究表明，几个受宿主限制的进化枝之间的进化关系反映了类人猿物种的进化关系。然而，基于饮食或肠道生理学的地理分离、宿主转移物种形成和宿主过滤等过程可以产生宿主限制性细菌进化枝并模拟宿主物种间的共同多样化模式。人类和其他类人猿都含有肠道微生物群，它们的组成在宿主中是不同的，有多个细菌谱系只在一个单一的物种中发现。为深入了解宿主限制性分类群的分布，作者检查了生活在很容易共享细菌菌株的条件下的圈养类人猿。通过分析圈养类人猿的肠道微生物组来评估共同多样化谱系的宿主特异性，圈养个体与他们的祖先种群分开，喂食替代饮食，并暴露于看护者和生活在附近的其他物种所携带的细菌，其中任何一个都可能破坏其野生同种物种的宿主微生物关联。尽管饮食和环境发生变化，并且在可能发生种间传播的情况下，仍能维持宿主限制性细菌分类群，这是宿主专业化和共同进化的有力证据。

在这项研究中，作者通过分析16S rRNA和更高可变的旋转酶B蛋白编码基因来调查野生猿、圈养猿和人类，以确定圈养猿中宿主限制性和共同多样化细菌谱系的动态。在研究圈养类人猿时，共同多样化的细菌谱系可以有三种潜在的命运：（1）它们可以在圈养的同种中持续存在，表明它们与宿主共同进化，（2）它们可以转移到不同的宿主物种，表明地理因素产生了共同多样化的原始信号，或者（3）它们可以被其他微生物分类群所取代，这表明宿主过滤是基于饮食的变化而发生的。

材料和方法

1 样品采集

类人猿粪便样本，包括倭黑猩猩 (n = 13)、黑猩猩 (n = 26)、大猩猩 (n = 22) 和猩猩 (n = 11)来自休斯顿动物园、哥伦布动物园、和Project Chimps（Blue Ridge，GA），并进行16S和回旋酶B（gyrB）扩增子分析。粪便样品（50-100克）沉积的12小时内收集并储存在-20℃下。

2 16s测序/gyrB -扩增子测序和文库制备、处理

①　16S rRNA 基因 V4 区域
②　引物：515F 、805R
③　测序平台：Ilummina
④　数据库：SILVA
⑤　检测单拷贝蛋白质编码基因促旋酶 B ( gyrB )的250 bp 区域的序列变异；
⑥　使用 Cutadapt从gyrB原始序列数据中删除适配器和引物序列，并使用DADA2 进行质量过滤。同时使用先前发布的野生类人猿采样大猩猩( n = 19)、黑猩猩( n = 48)、倭黑猩猩( n = 24) 和工业化人类( n = 16) 的数据扩充了gyrB数据集。

3 基于16s ASV的微生物组成分析

①　picante 和 Phyloseq R 包估计微生物多样性
②　 Kruskal-Wallis 和 Dunn 多重比较检验评估样本组是否在微生物多样性方面表现出显着差异，其中FDR 校正了PMCMR R 包中的p 值；
③　Bray-Curtis 和Jaccard 相异指数以及加权和未加权的UniFrac 距离来测量beta 多样性；
④　样品之间的成分差异通过 NMDS 排序可视化；
⑤　圈养状态和宿主物种的相对影响通过 PERMANOVA 进行了999 次排列测试，并且使用 Vegan R 包中的betadisper测试了组同质性的差异；
⑥　进一步研究在 NMDS 排序中观察到的趋势，通过在九个组的所有可能组合中进行成对 PERMANOVA 来确定组质心之间的距离 - 野生倭黑猩猩、野生黑猩猩、野生大猩猩、圈养倭黑猩猩、圈养黑猩猩、圈养大猩猩、圈养猩猩、非工业化人类和工业化人类。
⑦　使用双侧 Kruskal-Wallis 和Dunn 多重比较检验评估野生猿和圈养猿之间微生物属的相对丰度差异，并使用 Bonferroni 校正p 值；
⑧　采用多重 PERMANOVA 来评估地点、围栏、寄主物种和数据集对样本之间 Bray-Curtis 距离的相对影响。

结果

1 增加采样破坏了共同多样化的谱系

来自野生类人猿(n=130的gyrB扩增子数据)，圈养类人猿(n=72)，和工业化人类(n=16)在此研究和发表的数据，以及来自全球9000多人的宏基因组数据20（补充数据2），产生总共7596个asv对拟杆菌目进行分类。其中，6784个仅限于特定的宿主物种，将这些gyrB-asv组装成最大的单系支，产生356个支持良好的支，其成分存在于5个或多个宿主个体中（如图1）。

鉴于宿主之间采样的差异，作者只考虑了存在于25%以上的各种样本类型（即圈养黑猩猩、野生大猩猩、工业化人类等）个体中的宿主限制进化枝。对野生类人猿和人类的采样增加表明，Moeller等人报告的共同多样化谱系仅代表存在于野生猿和人类中的拟杆菌属多样性的一个子集。在拟杆菌门的系统发育中增加了许多受宿主限制的分支，允许重新检查最初报道的与类人猿物种共同多样化的谱系。两个最初的共同多样化谱系现在包含了来自人类的拟杆菌目序列的多样性，这些序列破坏了以前的共同多样化模式(图2、图S1)。在其他情况下，添加属于不同宿主物种的asv会产生混合宿主分支，破坏宿主和细菌系统发育之间的一致性。因此，新发现的宿主限制进化枝出现多次宿主转换事件后的细菌多样化可以更好地解释采样的增加。总的来说，作者发现通过额外的采样，以前描述为共同多样化的大多数谱系不再呈现与严格的共同物种形成一致的拓扑，现在包含宿主限制和混合宿主进化枝的混合物。尽管三个独立的统计测试为原始人类系统发育和类杆菌科谱系之间的共同多样化提供了重要支持，这些测试证明gyrb-asv更容易分为宿主限制的分支，但随机宿主树也产生显著的宿主限制关联，这一事实表明，基于距离的统计测试对于确定宿主限制分支的拓扑是否与共同多样化一致是不可靠的。

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Fig.1 基于拟杆菌目gyr B-ASV的宿主限制进化枝的系统发育。在左侧的系统发育中，三个标记和阴影的进化枝（Bt1、Bt2、Bt3）对应于Moeller等人确定的类杆菌科的共同多样化谱系。后面编号列中的颜色表示构成每个进化枝的 ASV 的宿主物种来源，第1列显示存在于至少五个个体中的所有356个进化枝的来源，第2列仅显示存在于任一进化枝中的65个进化枝任何宿主物种的野生或圈养个体，第3列仅显示存在于任何宿主物种的>25% 圈养个体中的18个进化枝。接下来两列中的圆圈根据寄主物种来源和大小进行着色，以表明包含进化枝的样本比例。对于圈养类人猿中突出的每个进化枝（带有白色背景的列），细菌家族和属的分类分配在最后一列中用颜色编码。

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Fig 2 共多样化拟杆菌科2中新的asv(图中Bt2).左上角的插图 (A) 显示了最初由 Moeller 等人确定的共同多样化进化枝的拓扑结构。用颜色编码的分支来表示宿主物种。该插图树中的五个主要进化枝（进化枝1-5）在系统发育（B）中突出显示并标记，其中包括新发现的gyrB-ASV。谱系和末端尖端用颜色编码以指示 ASV 的宿主物种来源，虚线对应于在圈养类人猿中识别的 ASV。一个新兴的混合宿主进化枝也被标记（进化枝6）.

2 圈养中野生猿宿主限制性ASV 的丢失和共享

作者最初着手确定野生类人猿中存在的共同多样化的细菌谱系是否在圈养类人猿中持续存在，这既证明了传播的保真度，尽管生活方式和地理发生了重大变化，并支持这些细菌谱系很重要的观点并可能与它们的宿主物种共同进化。然而，大多数宿主限制的gyrB进化枝在野生猿类物种中，这两个进化枝都是先前由Moeller等人确定的。并且通过这项研究，圈养猿不存在（图1）。同时作者观察到也存在于圈养类人猿中的野生黑猩猩宿主限制的野生黑猩猩进化枝的单个案例中，它不再局限于黑猩猩，而是在圈养黑猩猩和猩猩中都有发现。与野生猿不同，圈养类人猿主要拥有人类限制性、混合宿主和独特的圈养类人猿GyrB进化枝，这些进化枝在宿主物种之间广泛共享。

圈养类人猿微生物组的很大一部分不是包含存在于其野生同种中的菌株，而是由 16S-ASV 组成，这些 16S-ASV 仅限于人类，这与人类相关菌株的定植模式一致。事实上，在圈养类人猿中观察到的人类限制性 16S-ASV 的比例与人类没有显着差异（图 3B）（Kruskal-Wallis，df = 1，H = 6.4，p = 0.093）。即使在野生猿和人类中最常见的那些细菌属中（图3C），圈养猿的组成变化也是由人类限制性和混合宿主16S-ASV的增加引起的。研究结果发现野生猿通常具有仅存在于其他猿物种中的混合宿主ASV，而圈养类人猿往往具有同时存在于人类和野生猿中的混合宿主 ASV（图2），表明野生类人猿的额外采样不太可能发现与人类不成比例地共享的额外16S-ASV的宝库。

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Fig.3 圈养类人猿的组成变化与野生类人猿宿主限制性asv的丢失和人类宿主限制性asv的获得有关。(A)细菌门(B)宿主限制的类、野生类和工业化和非工业化社会的人类的肠道微生物群中、混合宿主16S-ASASVs、(C)细菌属和(D)宿主限制的16S-ASVs、混合圈养的16S-ASVs和唯一圈养的类16S-ASVs的平均相对丰度。值得注意的是，(C)中列出的几个属和宿主限制的16S-ASVs、混合宿主的16S-asv和独特的圈养猿类16s的平均相对丰度在所有圈养猿类中平行增加，影响微生物组组成的趋同。

3 没有证据表明圈养类人猿中存在宿主物种过滤

此研究能够比较来自多个位置的同一圈养大猿物种的肠道微生物组，能够确定微生物组组成对圈养中每个宿主物种的调整程度。如果宿主物种不同地过滤细菌菌株，则在控制动物园场地和围栏后，预计同一宿主物种的圈养类人猿将拥有更多相似的微生物组组成。在圈养类人猿中，动物园站点解释了由Bray-Curtis 距离评估的微生物组组成变化的 31%（PERMANOVA，df = 4，F = 10.6，p < 0.001，r 2 = 0.32；betadisper，df = 4，F = 5.3 , p= 0.004)，外壳解释了微生物组组成中另外 18% 的变化（PERMANOVA，df = 5，F = 4.9，p < 0.001，r2 = 0.18；betadisper，df = 9，F = 2.3，p = 0.024），并且在控制场地和围栏后，宿主物种与微生物组组成没有显着相关性。作者使用不同的采用方法提取和测序样本的研究数据，测试了研究来源对微生物组组成相似性的贡献程度（在控制地点和围栏之后），但没有发现显着影响。同时还比较了共享地理、宿主物种和围栏对共享16S-ASV 比例的相对影响（即索伦森距离，它不考虑 ASV 的相对丰度）。既不属于同一宿主物种也不居住在同一动物园地点的个体猿共享30% 的 16S-ASV（图4）。圈养类人猿之间的这种高度共享是不加区分的物种分配。同一圈舍中的圈养猿（总是同一物种）表现出最高比例的共享 ASV（±50%）（图4），远远超过共享地理或宿主物种的影响（排列t检验，所有比较，df = 1，t> 15.9，p= 0.012）。

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Fig. 4 同居圈养类表现出最高水平的ASV共享。圈养类人猿中共享的16S-asv(Sørenson相似性指数)与地理和宿主物种成员关系的关系。

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Fig. S6 比较同一动物园但不同宿主物种个体共享16S-ASVs(Sørenson相似指数)的比例。

4 类人猿物种的16S微生物组组成在圈养中趋于一致

圈养类人猿中放线菌丰度的减少伴随着放线菌多样性的减少；然而，圈养类人猿的总细菌多样性虽然因动物园地点而异，但与野生猿类相似（图S7）。所有圈养类人猿物种的六个细菌属的丰度都增加，包括人类微生物组中常见的瘤胃球菌科的多个属（图3C；补充数据6）。根据所有测试的指标，圈养类人猿微生物组与生活在非工业化社会中的人类更相似（图5和补充数据5；Bray-Curtis 距离；图S8，Jaccard，未加权和加权UniFrac距离）。圈养类人猿还表现出微生物属的相对丰度的损失，这些微生物属是野生类人猿物种特有的和区别于微生物组的（图S9）。总体而言，圈养使类人猿肠道微生物组均质化，使得个体表现出野生类人猿特有的微生物类群的丧失和人类中突出的类群的增加。

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Fig.5 基于 16S 扩增子测序的圈养类人猿肠道微生物群聚。圈养类人猿、野生类人猿和人类按物种和生活方式划分的肠道微生物组组成，并根据Bray-Curtis距离进行非度量多维尺度(NMDS)可视化(PERMANOVA, df = 8, F = 47.9, p = 0.001, r2 = 0.35;betadisper, df = 8, F = 44.0, p = 0.001).

讨论

1）圈养中类人猿物种的肠道微生物组变化情况；

圈养类人猿的微生物组为了解仅限于野生类人猿物种的细菌谱系的保真度和持久性提供了新的见解。基于对 16S-ASV 和变化更大的GyrB 的分析-ASV 在野生猿、圈养猿和人类中，作者表明圈养中类人猿物种的肠道微生物组发生变化并融合，这是由于其野生同种中存在的菌株的丧失和仅限于人类的菌株的增加。在控制场地和围栏后，圈养的类人猿没有表现出基于宿主物种的过滤证据。通过增加圈养类人猿的采样并纳入从广泛的宏基因组调查中提取的数据，作者确定了几个额外的宿主限制性菌株和进化枝，这些菌株和进化枝破坏了先前报道的与类人猿宿主共同多样化的细菌谱系的系统发育。在野生猿宿主中检测到的宿主限制模式并不反映宿主定殖的生物屏障，至少在当代时间尺度上，几乎没有证据表明宿主物种对菌株进行差异过滤。即使是圈养的同一物种的类人猿，也不会共享更高比例的 ASV，除非个体居住在同一圈地中，这表明细菌菌株的传播和共享具有很大的社会组成部分。

2）圈养中类人猿微生物组组成与野生类人猿的情况相异，存在差异的可能原因；

圈养的类人猿的微生物组组成无论宿主物种或地理位置如何汇聚，并与人类相似。这与野生类人猿的情况形成鲜明对比，其中微生物组组成特定于宿主物种，即使从多个物种同域并共享相同季节制度的地区取样。野生猿和圈养猿之间存在差异的一个潜在来源是，圈养物种食用类似的灵长类食物，并辅以人类常见的栽培水果和蔬菜，而野生猿物种即使生活在同一地理区域时也有不同的觅食方式. 尽管圈养类人猿通常生活在工业化人类附近（即在城市动物园中），但圈养类人猿的微生物组总是与非工业化人类的微生物组更相似。圈养的类人猿物种的密螺旋体和普氏菌的频率增加，这与非工业化人群中复杂碳水化合物的代谢有关，并与人类的情况形成对比，其中工业化与密螺旋体和普氏菌.。鉴于圈养类人猿的膳食纤维摄入量通常远低于野生种群，因此它们不会出现这种转变。

3）圈养相关的微生物的组成变化产生的原因；

作者检查了与圈养相关的微生物组的组成变化是由内源性野生猿品系的扩张或丧失还是由人类品系的定植驱动的。当圈养个体拥有人类常见但野生种群中不存在的细菌属时，很可能是在圈养期间获得了与人类相关的菌株。然而，在这个分类等级上评估细菌几乎没有提供关于它们的来源和传播的信息。通过在更精细的分类水平上检查变异，即单个ASV，作者发现圈养类人猿通常含有人类限制性菌株，这些菌株排除或取代了同一属的野生猿限制性菌株（例如，普氏菌和密螺旋体））。圈养猿类在多个地点丢失了野生猿宿主限制品系，包括那些属于先前被确定为与其类人猿宿主共同多样化的谱系的品系，表明宿主品系限制和传播不容易在圈养中持续存在。由于本研究中包括的大多数类人猿都是圈养出生的，并且未对其来源种群进行采样，因此我们无法追踪已丢失的特定野生猿宿主限制品系。

4）宿主限制性肠道细菌谱系；

作者确定了几种新的宿主限制性肠道细菌谱系，强调了在确定宿主限制模式和宿主与其微生物之间的共同多样化时采样的影响。通过增加采样重新检查类杆菌科的共同多样化谱系，产生了几个额外的谱系，这些谱系破坏了Moeller等人最初报道的共同多样化模式。这些新的细菌谱系大体上仅限于单个宿主物种，但它们的系统发育关系与其宿主的分支顺序并不完全一致。因此，Moeller等人报告的共同多样化模式可能反映了在地理上孤立的宿主物种中出现和多样化的细菌谱系，从而产生了宿主限制的进化枝。但是，类人猿只有3-4种宿主物种，宿主限制进化枝的选定子树的拓扑结构可能与宿主系统发育相似。我们应用随机宿主系统发育来表明，在许多密切相关的 ASV 仅限于不同宿主物种的情况下，很容易产生假阳性的共同多样化结果。因此，我们建议谨慎使用这些统计测试来推断哺乳动物及其微生物组成分之间的共同多样化：虽然这些测试可以处理宿主和共生体之间的多种关联。

5）导致宿主限制性细菌进化枝的出现的原因。

除了共同多样化和共同进化外，还有几种情况会导致宿主限制性细菌进化枝的出现：（i）扩散和宿主转移，其中细菌谱系在不同宿主物种定殖后多样化，(ii) 再生或复制，其中细菌在没有宿主物种形成的情况下进行物种形成，(iii) 细菌谱系的灭绝和/或置换。拟杆菌目虽然完全厌氧，但很可能在环境中分散到其他宿主物种中，并在种群中维持足够长的时间以在丢失或替换之前多样化为不同的进化枝。通过追踪野生猿种群在其圈养同种中维持的细菌菌株的分布，作者研究证明宿主限制进化枝在圈养中很容易丢失。这些受宿主限制的菌株在其宿主物种中缺乏持久性和保真度表明，至少在拟杆菌目内的谱系中，共生体与其宿主之间没有强烈的适应性依赖性或强烈的宿主选择性。通过对野生和圈养种群的配对观察，作者报告了圈养猿物种之间细菌菌株的现成传播与许多新报告的野生猿物种中宿主限制进化枝之间的巨大对比。