主题：肺癌的空间转录组文章搜集，结合找到的转移相关marker，看在肺癌空间上的情况。

Best practices for single-cell analysis across modalities

列举了单模和多模的单细胞数据分析的各个步骤，并讨论分析陷阱和建议

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转录组

表达矩阵是单模scRNA-seq数据分析工作流程的起点

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从原始矩阵到高质量细胞表达

从矩阵下来的流程主要是几步：

1. 去噪，质控
2. 标准化，去批次
3. 降维：
   • 为了确保分析仅关注具有生物学意义的基因并处理大型数据集，可以将计数矩阵简化为信息最丰富的特征。理想情况下，特征选择方法应该通过优先考虑亚群之间而不是一个亚群内的差异来选择解释数据集中生物变异的基因，而不影响小亚群的可识别性。偏差通过拟合基因模型来识别信息丰富的基因，该模型假设所有细胞中的表达恒定，并量化哪些基因违反了这一假设。正如独立比较所示，它在识别亚群之间具有高方差的基因方面表现良好，从而选择信息丰富的基因。此外，按偏差对基因进行排序是在原始计数上进行的，因此对标准化不敏感。
     特征选择后，可以通过主成分分析（PCA）等降维算法进一步降低数据集的维度（图 2a ）。 降维技术可用于底层数据拓扑的可视化或汇总。 在其他研究的基础上，PCA可用于数据汇总，t-SNE、UMAP和PHATE可用于更灵活的scRNA-seq数据可视化 5 , 48 。 值得注意的是，最近的一项研究表明，仅依赖 2D 嵌入可能会导致对细胞之间关系的误解，结果不应仅基于对这些表示的目视检查来制定，而应与定量评估相结合 49 .

从聚类到细胞鉴定

单细胞到聚类

Leiden算法，效率更高，避免不良聚类

细胞聚类到细胞鉴定

将聚类的细胞簇去映射到细胞类型等生物学解释的过程，可以手动或者自动。

三步法：

• 机器自动注释
  • 基于分类器的方法
    • CellTypist
    • Clustifyr
  • 基于现有的带注释的单细胞参考
• 手工标注
  • 利用每个细胞聚类的基因特征来注释细胞簇
    • 标记基因
    • 与文献标记基因比较
• 专家验证

挖个坑

A cellular hierarchy in melanoma uncouples growth and metastasis

黑色素瘤的细胞层次结构将生长和转移分开

背景

黑色素瘤包括：

• 增殖细胞-proliferative （黑色素瘤细胞-melanocytic）
• 侵袭细胞-invasive（间充质样细胞-mesenchymal-like）

但是发现这两类不全面，就又做了单细胞去看有没有别的细胞表型

小鼠单细胞评估黑色素瘤的多样性

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用一个黑色素瘤小鼠模型去做单细胞。先分出了 T 细胞、B 细胞、癌症相关成纤维细胞、树突状细胞、单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞 (EC)、周细胞和恶性群体（用的是已知的marker）。接着根据拷贝数变异和黑色素瘤特征基因表达鉴定黑色素瘤细胞，并UMAP降维成7种状态。

进一步分析：

• 一共是7个聚类
• MITF：黑色素瘤分化状态的关键调节因子，它诱导与黑素生成有关的基因，黑素细胞的主要分化相关功能，低 MITF 会导致去分化:
  • 在所有恶性细胞中检测到了MITF基因水平和转录水平的活性
  • 不同的转录程序与 MITF 活性的不同水平相关
    • 黑素细胞/增殖特征（MITF 高，PRO）
    • 间质样/侵袭特征（MITF 低；INV）
  • 来自聚类4的细胞表现出最低的MITF活性，表明这些细胞是所有恶性细胞中去分化程度最高的。

聚类间差异分析：

• 应用SCENIC确定了每种细胞状态的特定调节子，接着用基因集富集工具对每个簇进行功能注释（图 1c 和补充表 2 ），建立每个簇的基因表达特征（图 1d 和补充表 3 ），使用AUCell测量其活性并UMAP降维（图 1e ）
• 几个发现：
  • 这一批分析说明黑色素肿瘤的转录异质性不可以完全用黑素细胞（簇 0）和间充质样细胞（簇 6）概括
  • 来自簇 4 和 1 的细胞共享去分化神经嵴 (NC) 干细胞样细胞 (NCSC) 的标记，例如 Gfra2 、 Aqp1 或 Mef2c，但是两个类 NC 细胞群（1和4）呈现出不同的特征
    • 簇 4 的细胞除了表达多能性标记物如 Sox2 或 Klf4外，还独特地表达一组不同的标记物，包括 Notch3 、 Nestin （也称为 Nes ）或 Vcan

这个文章相对有些吃力，找了个笔记看了一下。 链接指路

尽管黑色素瘤的异质性和可塑性不像其他癌症一样那么高，但转录组上，黑色素瘤细胞仍呈现增殖（proliferative）/黑色素细胞（melanocytic）或间质样（mesenchymal-like）/侵袭性（invasive）两种状态。体内外模型数据显示，可能还有其他状态的黑色素瘤细胞存在。我们对于黑色素瘤肿瘤内部异质性了解尚不完全，尤其是不同细胞状态的起源及意义，负责肿瘤生长和转移的是不是同一细胞亚群等。

近日，来自比利时鲁汶VIB癌症生物学中心的Florian Rambow和Jean-Christophe Marine合作在Nature上发表了题为A cellular hierarchy in melanoma uncouples growth and metastasis的文章。结合小鼠遗传学、单细胞空间转录组、谱系追踪和定量模型，作者提出了黑色素瘤生长的层次模型，在细胞和分子层面上揭示了胚胎神经嵴细胞（neural crest, NC）状态特异性和分化的机理。文章提供了黑色素瘤细胞状态多样性和轨迹时空分辨率的图谱，揭示仅有特定细胞群具备支持肿瘤生长和转移的能力。

作者首先在携带Tyr::NRASQ61K/° 等位基因和缺失Cdkn2a (也称作Ink4a或p16INK4a)的小鼠模型中，验证了其重塑病人表型多样性的能力。而后对C57BL/6小鼠衍生合成系进行转录组图谱绘制，鉴定出T细胞, B细胞，内皮细胞（endothelial cell, EC）等8种细胞亚群和7种不同细胞状态（cluster 0-6）。MITF是黑色素瘤分化状态的关键调控因子，它在增殖/黑色素细胞中高表达，在间充质样/侵袭细胞中低表达。作者发现，cluster 0属于黑色素细胞型，cluster 6属于间充质型，它们对应神经嵴干细胞样细胞（NC stem-like cells, NCSCs）。Cluster 4的MITF活性最低且表达多能性marker，属于表皮间质转化前（pre-epithelial–mesenchymal transition, pre-EMT (premigratory)）的一群细胞，它是胚胎期最早出现的具有自我更新能力的NC细胞。以上结果表明，黑色素瘤细胞能够通过劫持NC细胞命运特化程序，去分化至 pre-EMT干细胞样状态，且这一结论与致癌基因突变无关。

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既然转录组上存在多样性，那么它们是不是有层次地被组织起来的呢？作者在C57BL/6小鼠移植模型中，利用诱导遗传谱系追踪，分别在2D切片和3D共聚焦成像水平，揭示了肿瘤样本中普遍的克隆大小异质性（一小部分克隆长的很快，大部分很小）。这与一个增殖层次结构很符合，即干细胞样的群体S，通过细胞复制随机扩大，产生第二个前体细胞样状态P，并再次通过复制扩繁。统计分析显示，在肿瘤长了10倍以后，存活的克隆中约有10-32%来自干细胞，其余来自祖细胞 (或non-cycling cells) 。类似地，将肿瘤植入免疫缺陷小鼠后，进行谱系追踪，发现与免疫功能完善背景下的克隆大小分布类似。以上说明黑色素瘤至少包含两个不同的细胞群体——干细胞样和前体细胞样，它们有着不同的生长动力学和命运决定。结合scRNA-seq数据后，作者推测S群体可能与与pre-EMT NC干细胞样群体重合。

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接下来，作者整合了空间转录组数据并利用空间增强分辨率组学测序 (stereo-seq)，揭示应激样（低氧）与最近血管距离正相关，而pre-EMT NC干细胞样与最近血管距离负相关。单细胞分辨率水平的分子绘图（Molecular Cartography）显示，0.8%（900/109,000）的细胞表达多种pre-EMT NC干细胞样markers,它们与最近血管距离的中位值显著短于低氧特征群体（图1）。以上都支持一个模型：pre-EMT NC干细胞样肿瘤细胞偏好定位在血管周围，产生更多S群体扩散至远端血管形成克隆或产生P类型的细胞远离生态位（niche）。通过在免疫缺陷的小鼠中共注射GFP+ ECs和黑色素瘤细胞、将ECs和黑色素瘤细胞共培进行scRNA-seq，作者均发现ECs有助于形成促黑色素瘤细胞去分化的生态位，从而促进肿瘤生长。这与DLL4 (ECs表达）——NOTCH3受体（pre-EMT NC 干细胞样群特异表达）相互作用有关，ECs对于肿瘤的促进作用依赖于NOTCH信号通路的激活。

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最后，作者聚焦于间质样细胞，发现PRRX1不仅可作为黑色素瘤间质样细胞群体的标志，也有助于间质样表型的获得和维持。利用Met-Track小鼠（详见图2），作者描绘了Prrx1阳性细胞在体内的命运，发现所有tdTomato+细胞低表达谱系marker，高表达Prrx1和其它间质样marker，值得注意的是，所有的细胞都不表达pre-EMT NC干细胞样marker。Prrx1群体对于原位肿瘤的扩张没有促进作用，所有的tdTomato+细胞在早期都不表达黑色素瘤型特征，但在晚期，有一小群细胞这个程序被激活。这提示，Prrx1间质样细胞（或其后代）在原位肿瘤中能够转换表型。

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此外，在淋巴结中，作者观察到高比例的tdTomato+细胞，在肝和肺中也有发现。早期标记的肺中tdTomato+细胞间质样特征高表达，Mitf表达极低，而晚期标记能够检测到Mitf，间质样特征不表达。这说明间质样细胞不促进肿瘤生长，但影响肿瘤转移。

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文章提供了小鼠黑色素瘤生态的高时空分辨率的图谱，解析了肿瘤生长和表型多样性的起源。黑色素瘤的生长由一小部分肿瘤细胞支持，而间质样细胞则成为肿瘤转移的后备力量。