m6A的前世今生
近年来，m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿最热门的研究方向之一，不断有CNS的文章问世，国自然资助的项目数量也逐年上升。
m6A是什么，m6A调控因子、m6A检测方法有哪些，m6A在人类疾病中扮演哪些作用。本文将做一简明阐述。
m6A概念
N6-methyladenosine也叫m6A，是一种广泛存在于mRNA上的碱基修饰行为，mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。
mRNA最常见的内部修饰包括了N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。N6-甲基腺嘌呤(m6A)在 mRNA 内部修饰碱基中所占比例最大，主要分布在 G(m6A)C (70%)或者A(m6A)C (30%)保守序列中。
早在20世纪70年代，Desrosiers. R等在人哺乳动物细胞的 mRNA 中发现了m6A的存在，但m6A的功能以及作用机制却一直鲜有研究。
直到 2011 年，芝加哥大学何川教授团队在 *Nat Chem Biol *发表文章“N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO”，揭示m6A的可逆化修饰，使 m6A 的研究重新热门起来。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图1 RNA常见的碱基修饰行为</figcaption>
m6A的分子改变是什么？
从图2中我们可以看到，这是一个已经发生甲基化的核糖核苷酸，确切地说叫N6-methyladenosine。
一共分为2个大的结构，左下角的是五碳糖，图2中a框部分也就是五碳糖的第二位C处的羟基发生脱氧就会变成脱氧核糖核苷酸（从RNA变成DNA）。图2中c框部分标注的，也就是第四位的C处通常会带有磷酸基。图2中b框部分通常就是我们所说的含氮碱基。
这里特指腺苷酸（A），当腺苷酸的第六位N处发生甲基化时，就是我们所说的m6A。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图2 N6-甲基化腺苷酸结构示意图</figcaption>
m6A调控因子
m6A这种甲基化修饰是可逆化的，调控因子包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等。
甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。
而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图3 参与m6A的酶类</figcaption>
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图4 m6A调控</figcaption>
甲基化转移酶（methyltransferase）也称为Writers，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白会形成复合物（complex），共同行使催化功能。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图5 METTL3、METTL14及其复合物结构</figcaption>
m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。
2011年，芝加哥大学何川教授团队首次证实， FTO蛋白是一种重要的去甲基化酶。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶，对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰。在细胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修饰水平显著上升。
发生m6A修饰的mRNA想要行使特定的生物学功能，需要甲基化阅读蛋白，也称为reader。阅读蛋白主要包括YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。这些阅读蛋白的功能主要包括特异性结合m6A甲基化区域，削弱与RNA结合蛋白同源结合以及改变RNA二级结构从而改变蛋白与RNA的互作。
m6A检测方法
目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS），常用的方法主要包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、LC-MS/MS以及比色法。其中LC-MS/MS和比色法能够检测mRNA整体的m6A水平，而MeRIP-seq和miCLIP-seq属于高通量测序手段。
LC-MS/MS在液相质谱的基础上采用串联质谱，获得分子离子峰和碎片离子峰，对碱基同时进行定性和定量分析。
LC-MS/MS法第一步使用TRIzol提取完总 RNA后，可以用oligodT磁珠或者rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA。
第二步使用核酸酶P1（Nuclease P1）将RNA消化成单个碱基。
第三步加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，将样本注射入液相色谱仪，计算各个碱基的含量。
第四步进入质谱串联分析，单个核糖核苷酸会被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤。最后根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。
LC-MS/MS为最早检测m6A的方法，操作较为繁琐。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取total RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图6 m6A检测方法 （A）LC-MS/MS法；（B）比色法。</figcaption>
2012年之前，全基因组或全转录组水平上鉴定m6A修饰的研究领域是一片空白。
2012年Meyer K. D发表于Cell上的论文“Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons”和Dominissini D发表于Nature上的论文“Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq”第一次从转录水平上，大范围、高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平。
这种方法被称为MeRIP-seq或m6A-seq。
MeRIP-seq操作第一步先对mRNA进行片段化，接下来使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化的mRNA片段进行富集，然后将富集到的mRNA片段纯化后构建高通量测序文库进行上机测序。另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。最后将2个测序文库放在一起进行生物信息学分析，得到m6A甲基化程度较高的区域（m6A peak）。
这种方法优点是方便快捷成本低廉，可以对发生高甲基化的mRNA区域进行一个定性分析。但是MeRIP-seq只能鉴定m6A高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。
2015年，Bastian Linder等发表在Nature Methods的文章“Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome”，第一次从单碱基的水平测定m6A。
这种技术被称为miCLIP-seq。
miCLIP-seq操作第一步对富集完的mRNA进行片段化。
第二步，使用带有m6A抗体免疫磁珠与带有m6A的mRNA片段进行结合。
第三步，使用紫外交联进行免疫共沉淀后，在mRNA片段的3’端连上接头序列，在5’端加上P32放射性标记后进行移膜。
第四步，根据放射性标记进行切膜回收后，对mRNA片段进行反转录和纯化回收。
第五步，对反转录组的cDNA进行环化。
第六步，对环化的cDNA进行复线性化，然后构建测序文库上机测序。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图7 高通量测序检测m6A （A）MeRIP-seq；（B）miCLIP-seq</figcaption>
m6A在疾病中的研究热点（2020年）
1. 肿瘤
2020年3月发表于Cancer Cell上的综述性文章“m6A Modification in Coding and Non-coding RNAs: Roles and Therapeutic Implications in Cancer”，文章指出，m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化不尽相同，环境改变和位点突变均可导致m6A状态的改变，同时m6A参与一些肿瘤靶向治疗基因的调控。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图8 m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化</figcaption>
2. 病毒感染
2020年2月发表于Nature Microbiology上的文章“N6-methyladenosine modification enables viral RNA to escape recognition by RNA sensor RIG-I”，文章指出，人类偏肺病毒（HMPV）在其RNA中获得m6A，可以模仿正常细胞的RNA，躲避免疫系统的检测。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图9 病毒中m6A的作用</figcaption>
3. 神经脱髓鞘改变
2020年1月发表于Neuron上的文章“m6A mRNA Methylation Is Essential for Oligodendrocyte Maturation and CNS Myelination”，文章指出，m6A去甲基化酶METTL14的减少会导致少突胶质细胞的减少及中枢神经的脱髓鞘改变，提示m6A在神经细胞的发育中起着重要的调节作用。
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<figcaption style="margin-top: calc(0.666667em); padding: 0px 1em; font-size: 0.9em; line-height: 1.5; text-align: center; color: rgb(153, 153, 153);">图10 m6A对神经系统发育的调控。</figcaption>
m6A的研究热点不断升级，今后会有更多的高分文章出现，关联的疾病也会越来越多。
但是，m6A的检测方法较为繁琐，所需费用也比较高，限制的m6A的研究进展以及临床应用，发展快速简便经济的检测方法是今后m6A检测技术的发展方向。
同时在研究层面，m6A作为十分重要的 RNA 表观遗传学修饰，如何与 DNA、组蛋白表观遗传学协同作用调控基因表达，也需要进一步深入探索。
参考文献
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