原代微血管内皮细胞的体外分离培养

微血管内皮细胞生长因子的应用和免疫磁珠技术的发展，使微血管内皮细胞的培养和纯化变得相对简化。

一、微血管内皮细胞培养简述

人体主要器官和组织的微血管内皮细胞已经培养成功的有：骨骼肌、心、脑、胃、视网膜、肺、皮肤、脉络膜、小肠、脂肪、肝窦、肾、关节滑膜、胎盘、骨髓、胰岛、角膜及食道等器官组织的微血管内皮细胞。

微血管内皮细胞排列在血管上，并有助于许多生物过程，例如血管生成，凝血，淋巴细胞的运输和炎症反应。微血管内皮细胞多种多样，具有特定的细胞特征和功能，具体取决于它们所在的器官/组织。脂肪组织是独一无二的，因为它具有在整个成年生活中不断生长的能力。因此，它具有高水平的血管生成，以提供脂肪组织所需的广泛血管化。研究表明，血管生成先于脂肪生成，这意味着微血管内皮细胞影响前脂肪细胞的增殖。同时，微血管内皮细胞生长受到脂肪细胞分泌的VEGG的刺激，表明组织发育过程中微血管内皮细胞与前脂肪细胞之间存在复杂的旁分泌关系。

二、微血管内皮细胞的分离

目前分离内皮细胞的方法主要有三种，即酶消化法、机械分离法和磁珠分离法。

酶消化法：优点是分离的细胞多、纯度较高；缺点是酶对某些蛋白有破坏作用。消化后的组织悬液需要用血清终止酶活性，并将组织悬液通过200目的金属筛去除未消化组织。

机械分离法和磁珠分离法：可以避免酶对内皮细胞的损伤，缺点是其他细胞的污染可能性较大。

磁珠分离法：利用特异的介质(表面有内皮细胞特异单克隆抗体的磁珠)从其他细胞群中分离出内皮细胞。这种方法虽然可以分离出可用于炎症研究的微血管内皮细胞，但是分离的细胞量少。

机械分离法：用于大血管内皮细胞的分离，这种方法避免了酶对内皮细胞的损伤和其他细胞的污染。

三、微血管内皮细胞的纯化

（1）纯化的方法：主要有利用尼龙网或不锈钢网筛过滤细胞悬液、物理刮除法、生长特性选择法、局部消化法、差速黏附法和免疫磁珠法等。

（2）生长特性选择法：根据内皮细胞的生长特性加以分离，即已贴壁的组织块，培养一段时间后除血细胞外，其他细胞尚未离开组织块而微血管内皮细胞最先游出，这时立即移去组织块，所留的大部分是血细胞和内皮细胞，血细胞经传代1代至2代后自动消除，剩下便是微血管内皮细胞。这种方法由于避免了对细胞的机械和化学损伤，且不需特殊设备，操作简单，较为可取。

（3）局部消化法：当不同类型的细胞群之间界限明显时，可在目的细胞区域滴加少量的消化酶，作用一段时间后，将消化液连同细胞吸出，再离心除去消化酶或终止消化后，将细胞接种于另外的培养板孔中进行培养。这种方法同物理刮除法一样，要求目的细胞的相对数量要大，并且与其他细胞界限相对明显。

（4）差速黏附法：内皮细胞较成纤维细胞贴壁牢固，用胰酶消化细胞，在倒置显微镜下监视，当成纤维细胞收缩变圆脱壁时，立即用含胎牛血清的培养基终止消化，随后轻轻吸去细胞液，大多数内皮细胞仍然保留在原培养板孔中。经过数次同样的处理，成纤维细胞基本可以被除去。

四、微血管内皮细胞的鉴定

到目前为止，还没有发现不同器官组织的微血管内皮细胞具有共同的特异蛋白或标志。

微血管内皮细胞的鉴定：

（1）根据器官和组织的起源，从形态、表型、生化和功能等方面进行综合评价。

（2）微血管内皮细胞一般呈单层生长，有接触抑制现象，呈典型的铺路石状，电镜下可以看到Weibel-Palade小体。

（3）表面表达CD31、CD34、凝血调节蛋白、第Ⅷ因子和选择素等，细胞可摄取低密度脂蛋白，产生前列腺素，内吞功能，结合植物血凝素，形成毛细血管样网络。

五、微血管内皮细胞的培养要点

根据微血管内皮细胞的生长特性，需要采用一些特殊的培养条件，并且这些培养条件可能因为微血管内皮细胞的起源不同而有所差异。微血管内皮细胞的培养一般选用基础培养基、胎牛血清、双抗、谷氨酰氨、内皮细胞生长因子。