早期人类胚胎发育:囊胚形成到原肠胚形成

Early human embryonic development: Blastocyst formation to gastrulation

早期人类胚胎发育:囊胚形成到原肠胚形成

最近人们对研究人类早期胚胎发育重新产生了兴趣。改善培养条件以在体外长期保持囊胚的出现，以及基于干细胞的囊胚和植入期胚胎模型的出现，为早期人类胚胎发生提供了新的信息。然而，谱系发育和胚胎模式的机制，以及参与其调控的分子途径，仍然没有得到很好的理解。近年来，随着大量技术进步，人们对人类胚胎发育的兴趣得到了重新激发。在这篇综述中，Rossant和Tam讨论了从体外培养人类胚胎和基于干细胞的胚胎模型中获得的关于人类胚胎发生的新见解。然后他们概述了仍然需要回答的问题

在受精后的头5至6天内，在受精前，人类受精卵发育成一个囊胚，该囊胚由包围着胚泡囊腔的营养外胚层（TE）外层组成，在胚泡囊腔内，内部细胞团（ICM）细胞群与胚泡囊一侧的TE不对称并置。ICM包含两种类型的细胞，外胚层和成釉细胞（在啮齿类动物中通常称为原始内胚层），后者在外胚层的管腔侧形成上皮层。与小鼠相似（Cockburn和Rossant，2010年），预计TE会在胎盘中产生滋养层细胞，表成纤维细胞有助于胚胎自身的细胞和组织，胚泡的进一步发育需要与母体子宫环境建立联系，以提供胚胎营养支持。这是通过胚泡的植入、成纤维细胞与子宫组织的相互作用以及胚泡囊肿嵌入子宫基质而实现的。

该植入期之后是原肠形成、胎盘形成和原肠形成后器官发生事件：胚胎发育的关键阶段，在此期间，通过有序生成不同的细胞类型和组装身体部位和器官的前体组织来建立发育蓝图（身体计划），当囊胚嵌入子宫组织时，胚胎就无法进行实验研究。关于早期人类胚胎发生的大部分知识都是从对在植入周围发育至原肠胚形成期间收集的罕见胚胎（卡内基CS5-7期胚胎）的形态学描述研究中收集的（O'Rahilly和Muller，1987）。由于材料的稀缺性和获取标本的技术可行性，对人类胚胎移植期发育的进一步研究一直受到困扰。在植入期内体外胚胎内发育囊胚的方法学进展（Deglicerti等人，2016；Shahbazi等人，2016年；Xiang等人，2020年）为研究这一重要时间段开辟了新的可能性（图1A）。然而，人类胚胎材料的研究受到不同司法管辖区的各种伦理和监管约束，可能会对材料的获取和体外胚胎实验分析的范围造成限制。特别是，所谓的14天规则，将完整人类胚胎的培养限制在受精后14天（dpf）和/或原肠胚形成的开始，已被广泛应用，并在许多司法管辖区的立法中得到了体现（Matthews和Moralıı，2020）。2016年，国际干细胞研究学会（international Society for Stem Cell Research）发布的国际指南中也将其列为推荐指南。然而，ISSCR干细胞指南（Lovell-Badgeet al.，2021）的最新修订表明，如果对延长培养期的必要性有一个明确且令人信服的科学理由，则可以用广泛的咨询审查程序取代禁令，受当地法律法规的约束（Clark等人，2021）。基于干细胞的集成和非集成胚胎模型的最新发展（Rossant和Tam，2021；Weath-erbee等人，2021）为人类胚胎研究提供了新的途径，可能较少涉及伦理问题，但显然需要针对正常胚胎过程进行验证。胚胎发育的细胞和分子机制的科学知识将为遗传性疾病和非遗传性先天性疾病的发育错误的机制基础提供信息

疾病，以及揭示早期胚胎丢失和妊娠紊乱的原因。在这里，我们提供了一个关于早期人类胚胎发生的快照，从囊胚-囊肿形成到整个植入后发育的直接阶段。

多年来，人们一直在研究人类发育的植入前阶段（Rossant和Tam，2017），这是在人类辅助生殖受精胚胎的体外胚胎腔条件发展之后（Johnson，2019）。合子基因组激活开始的时间、分裂期细胞分裂、致密化和胚囊形成的形态学变化以及母细胞囊肿细胞谱系的可见描绘都已被记录在案（Gerriet等人，2020b；Shahbazi，2020）。与小鼠的2细胞期（Schultz，1993年）相比，人类胚胎中的4–8细胞期（Braudeet等人，1988年）左右发生了融合基因组激活，随后的压实、极化和胚囊形成事件也比小鼠延迟。顶端极性的压实和建立标志着外部极化细胞的初始分离，这些细胞将继续形成TE，并在人类受精后的第3天和第4天之间发生（Iwata等人，2014）。最近的一项研究详细阐述了8–16细胞期人类胚胎中的致密化动力学，并表明跨膜磷脂酶特异性磷脂酶C（PLC）信号对顶端结构域的形成是必需的（Zhu等人，2021）。在最终的共振峰功能中，胚胎第6–7天（E）的人类囊胚，具有三种不同的细胞谱系，与小鼠囊胚非常相似，但谱系形成的详细机制可能不同。与小鼠相比，人类胚胎中谱系鉴定事件的知识仍相当初级。尽管参与小鼠谱系鉴定的一些主要基因，如Pou5f1（Oct4）、Nanog、Cdx2和Gata6，在早期人类胚胎中是保守的和被挤压的（Blakeley等人，2015；Nia-kan和Eggan，2013）和小鼠不一样

OCT4是小鼠ICM形成的关键转录因子（TF）（Nichols等人，1998年），在所有细胞中广泛表达，包括ICM和TE，直至扩展囊胚阶段，而CDX2是小鼠TE启动的关键调节因子（Strumpf等人，2005年），直到囊胚形成后才表达（Niakan和Eggan，2013年）。参与小鼠TE形成的其他基因，如Elf5和Eomes，在人类囊胚阶段不表达，而GATA3在小鼠TE形成中起辅助作用（Ralston等人，2010），在人类胚胎的TE前体中表达（Gerri等人，2020a；Petropoulos等人，2016；Zhu等人，2021）

随着人类胚胎单细胞RNA序列分析中基因表达模式和轨迹的信息越来越详细（Blakeley等人，2015年；Petropoulos等人，2016年；Stirparo等人，2018年；Yan等人，2013年）。最近根据胚泡发育的形态学标志绘制的已发表和新数据汇编，产生了一个伪时间轨迹，表明只有在胚泡形成并开始扩张后，ICM和TE谱系才分离（Meistermann等人，2021）。这与小鼠形成对比，在小鼠中，类似的肛门分析显示在桑椹胚晚期ICM和TE基因表达谱文件的初步分离（Posfai等人，2017）。人类表成纤维细胞和低成纤维细胞谱系分离的时间尚不清楚。早期的scRNA-seq研究表明，人类胚胎中的前成纤维细胞/后成纤维细胞分离事件实际上与ICM和TE谱系的分离一致（Petropoulos等人，2016）。

然而，最近的研究似乎显示，在外胚层和下胚层分化之前，存在一个短暂的共同ICM生成窗口（Meistermann等人，2021）。外胚层、下胚层和TE基因表达谱巩固的延迟可能表明，与小鼠相比，谱系命运的稳定也可能延迟（Rossant和Tam，2017）。关于测试人类胚胎谱系承诺的实验数据仍然非常有限，但一些研究与早期囊胚阶段的谱系可塑性一致。从E5人囊胚中分离出的体外细胞仍然可以用ICM细胞再生囊胚（DePaepe等人，2013），分离出的E6 ICM可以在培养中生成滋养层母细胞（Guo等人，2021）。鉴于小鼠胚胎中ICM和TE的分离是由细胞极性和细胞粘附的变化驱动的，导致在晚期分裂阶段内外细胞群的分离（回顾Asaki 2017），人类胚胎中ICM/TE分离的整个过程可能与小鼠不同。

然而，最近的一项研究表明HIP-PO-YAP-aPKC通路以与小鼠相似的方式驱动人类桑椹胚晚期/早期囊胚外层的形成（Gerri等人，2020a）。在这一阶段，scRNA-seq研究表明ICM和TE转录谱不明显，这表明这些早期事件是转录后的，在ICM和TE-谱系命运确定之前驱动胚泡形成的形态学事件。谱系规范通常与谱系特异性TFs的表达和功能相关。然而，对于人类卵裂球囊肿中驱动细胞命运的关键因子仍不确定。到目前为止，只有一种TF（OCT4）在人类胚胎发育过程中发生突变。CRISPR驱动的OCT4基因敲除表明，正常胚泡发育需要OCT4基因，但如果其唯一作用是确定ICM的命运，则这一要求似乎早于预期（Fogarty等人，2017）。人中CDX2的表达取决于OCT4的存在，而在小鼠中，Cdx2和Oct4显示胚泡阶段的相互抑制（Niwa等人，2005；Strumpfet等人，2005）。GATA3可以取代CDX2在TE规范初始阶段的作用，因为它确实对外部细胞显示出一些早期限制，并且当PKC在桑椹胚阶段被抑制时，其表达降低（Gerri等人，2020a；Zhu等人，2021）。发育中的低成纤维细胞中GATA6的表达（Boroviaket等人，2018；Petropoulos等人，2016；Xiang等人，2020）表明小鼠具有保守作用（Koutsourakis等人，1999；Mor-risey等人，1998），但目前还没有实验数据支持这一点。

在小鼠中，成皮细胞和原始内胚层的分离取决于ICM中细胞接收的FGF/ERK信号的局部水平（Saiz等人，2016；Yamanaka等人，2010）。然而，至少有两项研究未能证明FGF/ERK信号对人类ICM中细胞命运的依赖（Kuijk等人，2012；Roode等人，2012）。在人类ICM中，什么信号替代FGF/ERK尚不清楚。我们对人类胚泡形成的分子过程的了解仍有许多空白，这可能会被更多的实验研究所取代。然而，世界范围内对获取和使用人类胚胎进行研究有许多限制，这可能会限制发现。

其他哺乳动物，特别是非人类灵长类动物，已经进行了研究，但此类研究的获取和成本可能令人望而却步，与人类的差异仍然存在。因此，在胚胎发育的母细胞囊肿阶段（即所谓的胚状体），产生干细胞衍生胚胎模型的研究令人兴奋。Rivron实验室首次报道了从小鼠胚胎干（ES）细胞和滋养层干（TS）细胞的集合体中形成类似小鼠胚泡的结构（Rivron等人，2018）

原始内胚层发育不足，虽然这些结构可以植入子宫，但没有进一步发育。当声称具有胚胎外潜能的小鼠延伸潜能ES细胞（Yang等人，2017a，2017b）与TS细胞结合（Sozen等人，2019）或单独在悬浮培养中培养（Liet等人，2019年）时，产生了原始内胚层包含度提高的囊胚。这些胚泡在形态学上更像是胚泡，但在植入后仍未能发育，在完全ES衍生结构的情况下，基因表达分析并不支持所有外部细胞的真实TE身份（Posfai等人，2021b）。显然，即使在小鼠中，胚泡也不等同于胚泡。人类胚状体能成为更好的模型吗？从产生人类囊胚开始的逻辑位置可能是人类囊胚来源的干细胞的组合，其方式与小鼠相似。人TS细胞

在与用于产生小鼠TS细胞的培养条件不同的培养条件下，已经从囊胚和早期绒毛膜绒毛活检中产生（Okae等人，2018）。虽然它们是研究滋养层细胞分化的有用模型，但与胚泡TE相比，它们与植入后细胞滋养层细胞的关系更大（Castel等人，2020；Mischler等人，2021；Okae等人，2018）。也许正因为如此，目前还没有发表关于人类胚胎干细胞和TS细胞结合可能产生类人胚细胞的报道。Sozen等人试图通过制造与人类细胞相似的聚集物，通过将扩展潜能ES细胞与TS细胞相结合，重复其在促进小鼠囊胚全系发育方面的成功（Sozen等，2021）。然而，他们报告说，在这种聚集体中，外部TEcell的发育和维护较差。相反有一系列重新移植声称通过控制培养条件，但不添加任何特定的胚外细胞类型，直接从人类ES细胞中生成囊胚（Fan等人，2021；Liu等人，2021；Kagawa等人，2021；Yanagida等人，2021；Yu等人，2021）。

一项研究声称在成人细胞重新编程到诱导多能干细胞（iPSCs）（Liu等人，2021），而大多数其他研究都是从假定的原始状态的人类ES细胞开始的。此前有几份报告表明，处于原始状态的ES细胞根据适当的培养条件，保留了沿TE途径分化的一些潜能（Cin-kornpumin等人，2020；Dong等人，2020年；Guo等人，2021；Io等人，2021）。人类幼稚状态的这种可塑性在小鼠幼稚ES细胞中没有表现出来，可能与完整人类囊胚中ICM的可塑性有关。

一些已报道的人类胚泡在形态学和基因表达上确实与胚泡本身表现出惊人的相似性，但仍需对胚泡中细胞类型的基因表达谱与胚胎本身进行深入比较。上皮囊肿与闭合多能细胞的形成不足以证实功能性TE表型。人类类囊胚植入后的发育无法在体内进行测试，但3D在体外胚胎中的生长应与完整胚胎进行良好比较（Kagawa等人，2021）。为了验证这些潜在强大的实验模型，需要更多的数据，并与正常囊胚和植入后早期阶段进行仔细的比较。避免使用人类胚胎材料并将生产规模扩大到适合药物测试和其他研究的水平的能力，使得对囊胚的研究可能成为未来几年的热门话题。然而，尽管使用干细胞衍生的囊胚可以避免在研究中使用人类胚胎的监管和伦理问题，但它们确实有自己的法律和伦理问题。尽管卵裂球，甚至在小鼠中，目前还远远不是功能性胚胎的等价物，但人们对确定干细胞模型何时越过界线成为胚胎仍有一些担忧。在一些司法管辖区，胚胎学可能需要与胚胎本身一样的监管监督（Matthews和Moralıı，2020）。

最近修订的ISSCR干细胞指南考虑到了这些问题，并提出了所谓的综合干细胞模型，如胚泡（细胞类型可能产生功能性胎盘和胚胎），应受到特别监督，并限制短期培养（Lovell-Badge等人，2021）。还特别禁止将任何基于干细胞的胚胎模型移植到人类或动物宿主的子宫中

追踪胚胎和胚胎外细胞类型从着床前后到原肠形成的发育轨迹

支持植入期人类胚胎体外胚胎内发育的胚胎培养方法的完善为直接探索植入后即刻人类胚胎的细胞谱系关系提供了一个机会，发育解剖学在很大程度上证实了存档标本的记录(https://www.ehd.org/developmental-stages/stage6.php). 在没有子宫组织支持的情况下，囊胚可以将外胚层重塑为羊膜囊并形成卵黄囊，TE分化为与母体-胎儿界面相关的多种滋养层细胞类型（Deglicerti等人，2016；Shahbazi等人，2016）。在3D培养系统中开发的人类囊胚的最新研究捕捉到了相当于14 dpf的植入期胚胎形态发生的更好模型（Xianget al.，2020）（图1A）。

对来自42个3D培养胚胎的555个细胞的转录片段进行测序分析，确定了胚胎中的几种主要细胞类型（图1B）。与6–17 pdf食蟹猴胚胎中发现的一系列细胞类型的比较表明，人类胚胎细胞类型的对应物存在于食蟹猴胚中（Ma等人，2019；Nakamura等人，2016；Niu等人，2019），如着床后晚期外胚层、原肠化1、-2a和-2b细胞，在培养的人类胚胎中似乎没有发现，培养的人类胚的一些注释细胞类型似乎与猴胚中的对应细胞类型不同（Chhabra和Warmflash，2021）。目前尚不清楚这种差异是否与细胞覆盖深度和/或细胞谱系规格和分化的固有物种特异性差异有关。单细胞转录组数据中嵌入了细胞群体间谱系遗传的指示。基于有关经皮切片特征的接近性/连通性的信息，可以重建胚胎中细胞群在植入期至原肠形成期的发育轨迹（图2）。然而，体外胚胎发育的时间线限制在相当于7–14 dpf时期内，因此数据集可能无法涵盖原肠胚期晚期胚胎中存在的细胞类型。

最近对完整原肠期胚胎（16–19dpf，卡内基期CS7）的研究产生了外胚层、外胚层，中胚层、内胚层、神经板、后胚层、下胚层、卵黄囊和原始条纹（PS）细胞以及特定细胞类型（如原始生殖细胞（PGC）、红细胞和造血内皮祖细胞）的空间解析转录组（Tyser等人，2021）。因此，该数据集为植入前胚胎细胞谱系轨迹的发展终点提供了意义。通过分析培养的人类胚胎和CS7胚胎的单细胞转录组的连通性，可能推断出前因