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限制性内切酶，简称限内酶，是生物体内的可以将异源性DNA切断的一类酶，这可以限制异源DNA的侵入并使之失活，但对自身DNA没有损伤，可以维持细胞原有遗传信息的完整性。
限内酶可以是被DNA特异顺序序列即识别位点，并在识别位点内部或周围切割双链DNA。限内酶是分子克隆的基础。

• 限内酶有I,II,III三大类。基因工程中的一般指II类。其有专一的识别和切割位点，能识别专一的短的DNA序列，并在位点或附近切割DNA。
• 序列中被识别的位点多数有回文对称结构，长度一般4~8个碱基，常见为6个。切割位点在DNA两条链相对陈的位置。

REBASE(restriciton enzyme database）是常用的限内酶数据库，记录了内切酶的所有信息，包括内切酶识别序列和切割位点，甲基化酶，甲基化特异性等的文献。

限内酶位点分析常用工具是NEBCutter2，它所使用的数据库来自REBASE。

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使用

输入序列或GenBank number，submit

结果

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另外，前述的DNAMAN,BioEdit都可以进行限内酶分析。