全基因组扩增方法汇总

全基因组扩增技术（Whole genome amplification，WGA）能够实现对整个基因组的扩增以提供大量可供分析样品的技术

1.基于PCR 技术的WGA 方法

PCR-Based WGA

• 1.1 引物延伸预扩增法
  在所有WGA方法中引物延伸预扩增法（Primerextension preamplification，PEP）是较早出现的一种，PEP法是一种基于PCR技术发展而来的WGA方法，主要原理是使用15个碱基长的随机引物（N15，理论上有415种组合）在37℃的低退火温度下进行较长时间的退火，然后缓慢升温至55℃进行长时间的引物延伸，如此反复多个循环。但由于PEP法使用随机引物以及较为不严格的PCR循环参数，因此可能导致不均衡的扩增结果产生

• 1.2 简并寡核苷酸引物PCR
  简并寡核苷酸引物PCR法（Degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR）也是一种基于PCR技术的全扩增方法，其原理是使用部分简并的引物进行PCR反应（引物中间部分含有6个随机碱基），在最初的几个循环过程中使用较低的温度（_{25℃）进行退火以确保引物与模板的结合，并缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后使用相对较高的退火温度（}55℃）进行多循环常规PCR 反应，对DOP-PCR 结果影响较大的是因素是聚合酶及引物浓度。DOPPCR法虽然使用相对PEP法更为严格的PCR反应条件，但引物与模板间结合的不确定性以及引物间的相互作用仍可能导致较低的全扩增灵敏度及较高的错误率，因此，较大程度上限制了该方法的应用

• 1.3 连接介导PCR
  连接介导PCR（ligation-mediated PCR，LM-PCR）指的是一类有接头连接过程参与的PCR反应LM-PCR全扩增技术需要通过3个步骤来实现：（1）模板DNA的片段化处理：可通过物理剪切或限制性内切酶处理使基因组DNA断裂成若干适合PCR扩增的片段。使用物理剪切法对DNA进行处理时因无法预测片段末端结构，因此需要对其进行平末端化处理以满足其与接头进行连接的条件，如使用限制性内切酶对模板进行剪切，因各片段末端组成已知，因此大多数情况下无需对片段进行处理；（2）模板片段与接头连接：根据酶切片段类型设计可与之连接的接头，在DNA连接酶的作用下与模板片段两端连接，接头中含有一段外源通用引物序列，用作下一步PCR反应中的引物；（3）全扩增PCR反应：连接成功的模板片段经引物延伸后两端形成了通用引物结合位点，因此可以外源引入的通用引物进行PCR反应，包括接头在内的模板片段可同时得到扩增

2.恒温全基因组扩增反应

• 2.1 MDA：多重置换扩增反应
  基于恒温核酸扩增技术的多重置换扩增法（Multiple displacement amplification，MDA）的出现相对PCR类全扩增方法较晚，其基本原理是使用一条硫代修饰的六核苷酸随机引物（N6）在恒温条件下与基因组随机退火，并在具有强链置换活性的phi29 DNA聚合酶的作用下发生链置换扩增反应，置换产生的单链序列又可与随机引物任意退火延伸，形成超分支扩增结构，由于phi29 DNA聚合酶具有较强的持续合成DNA的能力，因此可持续合成长达50-100 kb 的产物。由于MDA 法是一种恒温核酸扩增方法，可能存在一定的非特异性扩增问题，即体系内不含有模板时也会产生大量产物。MDA 法是目前公认应用最广泛的WGA方法，操作简单且对实验仪器的要求极低，且使用非预变性的模板时也可取得良好的WGA效果，可进一步简化实验操作及避免污染的产生，可广泛应用于基因组测序、CGH、SNPs 分析等相关领域，目前针对该方法开发的产品较为成熟，具有代表性的为Qiagen 公司的Repli-g系列全扩增试剂盒

  
  MDA
• 2.2 pWGA：基于引物酶的全基因组扩增
  由T7细菌噬菌体核酸复制方式演化而来的基于引物酶的全基因组扩增（Primer-based whole genomeamplification，pWGA）是一种恒温全基因组扩增方法，相对于其他所有WGA方法，pWGA最大的特点是在扩增过程中不需要使用任何引物，且其不需要对模板进行预变性处理。pWGA过程中所需的T7 gp4蛋白可同时发挥解旋酶和引物酶的作用，该蛋白的C端部分可利用脱氧胸苷三磷酸（dTTP）水解产生的能量来将DNA双链解旋；而N端则行使引物酶（primase）的作用，其特异性识别3'-CTGG（G/T）-5'和3'-CTGTG-5'并产生短的RNA作为扩增引物。引物生成后在T7 DNA 聚合酶全酶的作用下进行持续的扩增反应，由T7 gp2.5基因编码的单链DNA 结合蛋白（Single-stranded DNA binding protein）与解旋产生的单链DNA结合并与解旋酶/ 引物酶、聚合酶一起完成整个全基因组扩增过程，该扩增模式与滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）相似并可以产生长达40 kb 的产物

3.MALBAC：多次退火环状循环扩增技术

多次退火环状循环扩增技术（Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）结合了MDA法与PCR方法的特点，使用的35 nt长的引物，由一段固定的27 nt通用引物序列和8 nt随机碱基序列（N8）组成，在0℃时该8 nt随机碱基序列可与模板任意退火，梯度升温至65℃后在具有链置换活性的Bst大片段DNA聚合酶作用下发生链置换聚合反应，得到一系列长度不一的（0.5-1.5 kb）半扩增子（Semiamplicons），在94℃变性、0℃退火以及65℃延伸循环后，上一循环中半扩增子形成了两端具有互补结构（27 nt）的全扩增子（Amplicons），随后降低温度至58℃使得到的扩增子两端互补形成loop结构，从而可以避免引物与其进行结合导致全扩增子倍增导致的不均衡扩增，因此可以很大程度上保证该循环发生的是线性扩增。在经过5个上述类似线性扩增循环后可得到大量全扩增子并做为接下来PCR反应的模板，并使用该27 nt通用引物进行指数PCR反应，因此只有全扩增子才能得到有效扩增，从而实现对整个基因组的高效而又均衡的全扩增

MALBAC

4.转座子插入线性扩增Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI)

谢晓亮教授在Science上的报告了一种改进的单细胞的WGA法：通过转座子插入进行线性放大。DNA被含有T7启动子的Tn5转座子随机片段化，T7启动子允许线性扩增。LIANTI法优于现有的方法，能在千碱基分辨率进行微CNV检测。这允许直接观察从细胞到细胞不同的，随机发生的DNA复制起始。

LIANTI

5.主要全基因组扩增方法比较

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Reference

1.潘孝明, 梁兴国. 全基因组扩增技术原理及研究进展[J]. 生物技术通报, 2014 (12): 47-54.

2. Chen C, Xing D, Tan L, et al. Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI)[J]. Science, 2017, 356(6334): 189-194.
3. Van Loo P, Voet T. Single cell analysis of cancer genomes[J]. Current opinion in genetics & development, 2014, 24: 82-91.
4. Huang L, Ma F, Chapman A, et al. Single-cell whole-genome amplification and sequencing: methodology and applications[J]. Annual review of genomics and human genetics, 2015, 16: 79-102.