三十六策 第 9 策 因材施教

三十六策 第 9 策 因材施教

三十六策 第 9 策 因材施教

套路来源于文献，又高于文献，是文献中普遍存在的论证规律。

三个阶段：

第一阶段，看山不是山，看水不是水

第二阶段，看山是山，看水是水

第三阶段，看山不过是山，看水不止是水

一项完整的蛋白功能研究它的标准：

1. 检测分子的基础表达

   • 分子为变量的研究中第一个 Figure 往往是检测目标分子的表达水平。

     • 把病理组织和对照组进行比较，搞清楚疾病过程中这个分子在组织中的表达是否明显改变了，这种改变还可以结合其他病理特征进行统计分析

     • 检测细胞模型的表达变化或者动物模型的特定组织中的表达改变。

     • qPCR 、 WB、组织还要做免疫组化

     • 过表达了获得表型，沉默了失去表型

     • 检索基因序列的数据库： Gene、Nucleotide 和 Protein

2. 制作过表达或者沉默的载体工具

   • 腺病毒：用于基因过表达实验的载体，做 RNA 干扰的时候免疫源性比较强，不推荐

   • 慢病毒：适合于做 RNAi 实验、CRISPR 实验

   • shRNA：发卡状的 shRNA 正是 siRNA 的前体，在细胞里面会被自动切割加工为 siRNA，质粒和病毒载体上都会用shRNA的结构

   • 把质粒或者病毒导入到细胞内，抽提细胞的 mRNA 和蛋白，检测它的表达情况在组织和细胞里检测表达差异一样，还需要设置一个阴性对照

     • 过表达实验里是空载体，里面没有负载任何基因

     • 在 RNAi 实验里是一段打乱序列不影响任何基因表达的序列，也就是无效的 siRNA

   • Fig.2 里面的小图 a，应该先提供过表达或者沉默有效的证据

3. 检测表型功能的实验

   • Fig.2 剩下的那些小图

   • in vitro的结果

4. 体内动物实验

   • Fig.3 in vivo的表型验证

5. Rescue 实验 回复实验

   • 同一个条件下先正向再反向，或者先反向再正向观察表型的得而复失或者失而复得

   • 很好排除现象背后的假阳性本质，建立可靠的因果逻辑

   • 单变量论证

     • 先把基因用 siRNA 沉默掉

     • 稳定沉默这个基因的细胞分两组

     • 一组转对照，另一组转入过表达载体，然后观察表型变化

     • 过表达后能够把原来沉默失去的表型回复回来，证明该表型是依赖于这个分子存在而存在的

总结

五步总结起来是 12 个字——表达差异、正反回复、细胞动物