导读

• 宏基因组分箱（Binning）是将宏基因组测序得到的混合了不同生物的序列或序列组装得到的contigs按物种分开归类的过程，类似下图[1]。传统的单物种全基因组序列都是经纯培养之后，再进行全基因组de novo测序才获得的，但是环境中存在着大量的不可培养微生物，宏基因组分箱技术有助于获得不可培养微生物的全基因组序列，获得新物种的基因组序列和功能，预测未知物种的培养方法等等。

  
  分箱.png

一、分箱工具盘点

• 早在2011年，science上的一篇文章就用了宏基因组Binning技术对来自牛瘤胃的样本进行了宏基因组测序研究。该研究从268 Gbp的宏基因数据中成功Binning出了15个不能培养的微生物的全基因组序列（可见分箱对数据量要求很大）。从那以后，宏基因组Binning技术开始被更多的人关注和重视，也逐渐出现了很多宏基因组Binning工具。查了一些文献和资料，我罗列了一下近几年的分箱工具，引用量仅供参考（google学术，2019.8.29）。

分箱工具	发表杂志	发表时间	引用量
ProxiMeta	Genome Biology	2019	1
MetaBAT2	PeerJ	2019	4
MetaWRAP	Microbiome	2018	14
DAS Tool	Nature Microbiology	2018	59
Binning_refiner	Bioinformatics	2017	13
COCACOLA	Bioinformatics	2017	56
CoMet	BMC Bioinformatics	2017	4
MetaBAT	PeerJ	2015	465
MaxBin 2.0	Bioinformatics	2015	211
VizBin	Microbiome	2015	110
Anvi’o	PeerJ	2015	279
CONCOCT	Nature Methods	2014	429
GroopM	PeerJ	2014	188
MetaCluster 5.0	Bioinformatics	2012	115
PhyloPythiaS	Plos One	2012	99

二、分箱工具比较

1. 2017年Nature Methods上一篇文章对宏基因组数据处理各个过程中的软件进行了评估[ Critical Assessment of Metagenome Interpretation-a benchmark of metagenomics software ]。从文章的分析结果来看，不同的方法各有优缺（下图），MaxBin2可能是相对较好的一个分箱软件。

• 比较结果：

  
  NM.png

2. 加利福利亚大学在通过整合多个算法设计出了新的Binning软件DAS tool并在2018年发表在Nature Microbiology上 [ Recovery of genomes from metagenomes via a dereplication, aggregation and scoring strategy ]。集合了多个算法的DAS tool各项Binning指数要明显优于CONCOCT，MaxBin 2，MetaBAT等方法，比较分析结果如下：

• 比较结果：

  
  对不同样本来源的宏基因组数据进行分箱完成度分析.png
  对模拟微生物群落进行基因组重建分析.png

3. 同年，Microbiome上发表了另一个整合了多个工具的分箱分析流程MetaWRAP [MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis. Microbiome]。

• MetaWRAP流程不仅纳入了最流行的MetaBAT、CONCOCT和MaxBin2分箱方法，还整合了质控、拼接、分箱、提炼、评估、注释等多种功能。MetaWRAP可以解决分箱分析中可能遇到的绝大多数问题，而且比较分析发现综合多个工具的MetaWRAP分箱法不仅比单个工具分箱效果好，也比同样是综合多个算法的DAS tool分箱法效果好，比较分析结果如下：

• 比较结果：

  
  完成度和污染度的比较（CAMI数据集）.png
  完成度和污染度的比较（水、肠道、土壤数据）.png
  metaWRAP重组装分箱效果更佳.png

三、分箱实战

• MetaWRAP集合的算法和工具很全很多，但是也很慢，有条件的话可以自己尝试使用MetaWRAP。[Extensive Unexplored Human Microbiome Diversity Revealed by Over 150,000 Genomes from Metagenomes Spanning Age, Geography, and Lifestyle. Cell. 2019]这篇文章提到，MetaBAT2在单样本分箱中表现最佳，也在Metawrap文章中表现不错。Metawrap看似有前途，但是存在两个缺点：1）没有独立验证；2）计算成本高。考虑到时间，下面只以MetaBAT2为例简介分箱工作流程。

1. 准备

• 下面是需要的软件和数据：

• MetaBAT2分箱工具地址：
  https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/src/master/

• CheckM分箱质检地址：
  https://github.com/Ecogenomics/CheckM/wiki

• MetaBAT2测试数据地址：
  https://portal.nersc.gov/dna/RD/Metagenome_RD/MetaBAT/Software/Mockup/

测试数据.png

• 下载得到已经组装好的contigs文件assembly.fa和两个样本的bam文件。

2. 统计contig深度

jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth depth_var.txt *.bam

• 统计结果：

  
  contigs深度.png

• 结果说明：
  第一列：contigName
  第二列：contigLen
  第三列：totalAvgDepth
  第四列：library1.sorted.bam
  第五列：library1.sorted.bam-var
  第六列：library2.sorted.bam
  第七列：library2.sorted.bam-var

3. 分箱(4线程，21秒)

time metabat2 -t 4 -i assembly.fa -a depth_var.txt -o metabat2/bin –v

• 分箱结果：

  
  分箱结果.png

4. 分箱评估 (4线程，32分钟)

time checkm lineage_wf -f metabat2/checkm.txt -t 4 -x fa metabat2/ metabat2/checkm/
##  评估结果保存在checkm.txt文件中。

5. 评估结果：

• 提取ID，Taxonomy，Completeness，Contamination信息：

grep 'bin' checkm.txt | sed 's/^  //' | awk '{print $1,$2,$13,$14}' | sed 's/\ /\t/g'| sed 's/\./\t/' | sort -n -k 2 | sed 's/\t/./' > test.txt
##  从checkm.txt提取

• 提取结果：

  
  分箱评估结果.png

第一列：Bin Id
第二列：Marker lineage
第三列：Completeness
第四列：Contamination

结束语

• 到此就完成了两个样本的宏基因组分箱和分箱评估工作。这只是宏基因组分箱的简介，更全更详细的分箱分析可以参考MetaWRAP分析流程。

• MetaWRAP分析流程地址：
  https://github.com/bxlab/metaWRAP/blob/master/Usage_tutorial.md

参考：

1. 句句干货！一文读懂宏基因组binning
2. Microbiome：宏基因组分箱流程MetaWRAP简介
3. 宏基因组分箱Binning以及MaxBin的使用