解剖式学习一个质粒结构--做知识的搬运工

第一次看到以下这种质粒map的时候，我的脑袋是空白的，最近在师兄的指导下，也做了一些转化、扩增、提质粒、酶切和连接等工作。但是实际上我对质粒的结构不是很明白，有时候师兄在说一些东西我没能完全理解透，等到自己琢磨的时候遇到问题回去再问，师兄会说，我已经跟你说过了，嘤嘤嘤o(╥﹏╥)o，所以我决定，搬起小板凳好好的把这个给学一学，就算学不完，总算加一点点基础也是好的。

举个例子：Puro-Cas9 donor (Addgene #58409)

Puro-Cas9 donor

1. Ori

从序列开始看

https://zh.wikipedia.org/wiki/Ori

Ori指的是脱氧核糖核酸序列上有一个固定的复制起始点，有时也被叫做origin。在原核生物中，如大肠杆菌（E.coli）的DNA序列上，在第82等分位点上，便存在有该复制起始点，该点被称作OriC。该OriC的DNA跨度为245bp，分析它的碱基序列，可以发现这段DNA是由3组延续的重复序列与2对反向的重复序列所组成的。

在细菌的接合生殖过程中，在oriT ('T'是transfer的缩写) 的FAT质粒序列上开始以滚环式复制的模式进行DNA复制。

不同于原核生物仅有一个复制起始点，真核生物中往往有多个复制起始点，并且是分开复制而并不是同步复制的，即时序性；且复制起始点比E.coli的OriC要短。如酵母菌的DNA复制起始点仅仅包含11bp的富含AT的核心序列，又叫做自主复制序列（ARS,autonomous replication sequence）。

在许多生物的线粒体DNA中包含有两个Ori序列。在人类中，他们被称为oriH和oriL，前者位于该线粒体的重链DNA，后者位于该线粒体的轻链DNA。每一个Ori序列都是线粒体的复制起始点。

2. CAP binding site

CAP，Catabolite activator protein 激活蛋白

https://en.wikipedia.org/wiki/Catabolite_activator_protein

CAP结合位点，显然是为CAP蛋白准备的。

Catabolite activator protein (CAP; also known as cAMP receptor protein,****CRP) is a trans-acting transcriptional activator that exists as a homodimer in solution.

Each subunit of CAP is composed of a ligand-binding domain at the N-terminus (CAPN, residues 1-138) and a DNA-binding domain at the C-terminus (DBD, residues 139-209).[[1]](https://en.wikipedia.org/wiki/Catabolite_activator_protein#cite_note-Busby-1)[2] Two cAMP (cyclic AMP) molecules bind dimeric CAP with negative cooperativity. Cyclic AMP functions as an allosteric effector by increasing CAP's affinity for DNA. CAP binds a DNA region upstream from the DNA binding site of RNA Polymerase. CAP activates transcription through protein-protein interactions with the α-subunit of RNA Polymerase.

**(i) catalyzing the formation of the <u>RNAP-promoter closed complex</u>; and (ii) isomerization of the <u>RNAP-promoter complex to the open confirmation</u>. CAP's interaction with RNA polymerase causes bending of the DNA near the transcription start site, thus effectively <u>catalyzing the transcription initiation process.</u> **

3. lac promoter and operator

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https://en.wikipedia.org/wiki/Lac_operon

promoter for the E. coli lac operon

The lac operon (lactose operon) is an operon required for the transport and metabolism of lactose in Escherichia coli and many other enteric bacteria. Although glucose is the preferred carbon source for most bacteria, the lacoperon allows for the effective digestion of lactose when glucose is not available through the activity of beta-galactosidase.

大肠埃希菌及其他肠杆菌消化乳酸的操纵子，promoter是启动子，启动子后面跟着操纵子的基因，结合在一起才可以起作用，另外图上紫色的部分，都是各种引物

4. M13 REV

M13 REV : common sequencing primer, one of multiple similar variants

M13 fwd: common sequencing primer, one of multiple similar variants

5. T3 promoter and HA-L, HA-R

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5.1 T3 promoter：如图所示

5.2 HA-L: left homology arm from the adeno-associated virus integration site (AAVS1) within intron 1 of the human PPP1R12C gene; HA-R: right homology arm from the adeno-associated virus integration site (AAVS1) within intron 1 of the human PPP1R12C gene.

这里需要补充AAVS1的相关背景知识，我就不补充了，但是一定要了解这个位点。

6. SA，T2A and puro-R

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6.1 SA：splice acceptor site

6.2 T2A：2A peptide from Thosea asigna virus capsid protein （相应的还有F2A，P2A，E2A等等，主要是来源不同）

6.3 puro-R：puromycin抗性基因

https://en.wikipedia.org/wiki/2A_self-cleaving_peptides

T2A的存在，能够把融合蛋白拆开来表达~

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7. bGH poly(A) signal

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bovine growth hormone polyadenylation signal

https://baike.baidu.com/item/%E5%8A%A0%E5%B0%BE%E4%BF%A1%E5%8F%B7/4791563

http://www.novopro.cn/articles/201607201130.html

bGH即是较弱的加尾信号

poly(A) tail：真核生物mRNA的3’端都有一段） [1] ，这种尾巴不由基因编码，而是在转录后加到mRNA上的。加尾过程受位于终止密码3’端的加尾信号序列所控制。 在结构基因的最后一个外显子中有一个保守的AATAAA序列，此位点下游有一段GT丰富区或T丰富区，这两部分序列共同构成poly(A)加尾信号。

哺乳动物细胞表达质粒主要是用于转录出mRNA， 常用的转录终止子有SV40, hGH, BGH, 和rbGlob，同时包含有AAUAAA基序促进聚腺苷酸化和转录终止。除了上面列出的，SV40 late polyA 和rbGlob polyA被认为可以更加有效的终止转录。

有一点特别需要注意的是，哺乳动物细胞的poly(A)信号和病毒包装系统的联合使用可能会降低病毒滴度，延长转录本的寿命，所以处理的时候需要谨慎一点。因为这个原因，病毒载体通常会使用其他非poly(A)的转录本稳定元件和出核元件，如WPRE和CTE或者使用其他弱的poly(A)信号，如BGH 。

拜托以后看到加粗字体的内容，就知道这是一个转录终止子的信号哦~

8. attB1 and attB2

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Gateway BP reaction

http://www.dxy.cn/bbs/topic/25258654

Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。

Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。

在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。

同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。

bipartite nuclear localization（NLS）signal from nucleoplasmin （核纤溶酶的二部核定位信号 ）

https://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_localization_sequence

A nuclear localization signal or sequence (NLS) is an amino acid sequence that 'tags' a protein for import into the cell nucleus by nuclear transport. Typically, this signal consists of one or more short sequences of positively charged lysines or arginines exposed on the protein surface. Different nuclear localized proteins may share the same NLS. An NLS has the opposite function of a nuclear export signal (NES), which targets proteins out of the nucleus.

9. SV40 NLS, 3xFLAG, Kozak sequence, attB1, tight TRE promoter and tet operator

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9.1 SV40 NLS，我们上面提到过

They found significantly higher nuclear localization efficiency of c-Myc NLS compared to that of SV40 NLS，他们发现c-Myc NLS比SV40 NLS的和定位效率更高。说明这两个都是一个核定位因子，与上面提到的一致。

NLS is an amino acid sequence that 'tags' a protein for import into the cell nucleus by nuclear transport. NLS是一个可以标记蛋白的氨基酸，以便于被和细胞核转运体转运到细胞核中，实现核定位功能。

9.2 3xFLAG

three tandem FLAG® epitope tags, followed by an enterokinase cleavage site. 三个串联FLAG®表位标签，接着是肠激酶裂解位点 。

9.3 Kozak sequence

vertebrate consensus sequence for strong initiation of translation (Kozak, 1987) 脊椎动物共有的，转录的强启动因子

9.4 attB1 上面提到过

9.5 tight TRE promoter and tet operator

Tet-responsive promoter PTight, consisting of seven tet operator sequences followed by the minimal CMV promoter

10. T7 promoter

T7: promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase

11. ccdB

ccdB, a bacterial toxin that poisons DNA gyrase。 ccdB就是前面在gateway reaction里面提到过的自杀基因，ccdB是一种细菌毒素，可以破坏DNA旋转酶。

12. AmpR

这个就不说了。