最新7.3分非肿瘤生信，热点基因集+免疫浸润+WGCNA+调控网
影响因子：7.31
关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因。
2 单个疾病结合免疫浸润，铁死亡，自噬等基因集，机器学习算法等。
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析
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研究概述：
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病。免疫代谢和氧化应激之间存在复杂的相互作用。为了确定AS中的氧化应激和免疫相关的生物标志物。本文利用GEO数据集识别并鉴定与氧化应激相关的DEGs。其次利用生物信息学方法比较AS和对照样品免疫浸润水平的差异，构建PPI网络鉴定出关键的AS诊断标志物，并在其他数据集中进行了验证。利用相关性分析和单细胞分析，表明ALOX5和NCF2是铁死亡的差异表达基因。随后利用PCR、免疫组化(IHC)和免疫印迹(Western Blot)等实验证实斑块组织中相关基因的表达。
研究结果：
一、DEGs的识别及分析
1、对GSE100927数据集进行差异基因分析共获得2417个DEGs，GSEA分析共鉴定出389个OS相关基因，通过与DEGs交叉获得74个差异DEOSGs。（图1a-b、图2a）
2、GO分析结果显示，上调的DEOSGs在氧化应激等方面富集，下调的DEOSGs在氧化应激、肌动蛋白结合等反应中富集（图2b、d）。
3、KEGG分析显示，上调DEOSGs主要富集在糖尿病心肌病、动脉粥样硬化等途径，下调DEOSGs主要富集在肥厚性心肌病和MAPK信号通路等途径（图2c、e）
二、免疫浸润分析及共表达网络共建
1、通过AS和正常样本中22种免疫浸润细胞的富集分数可知，AS和对照组之间有14种免疫细胞类型存在显著差异（图3、4）。
2、矫正样本后进行WGCNA分析共鉴定出12个相关模块，通过模块的相关分析和免疫特征分析发现绿松石模块与巨噬细胞M0高度正相关，蓝色模块与T细胞高度正相关（图5a-c）。
3、对上述模块进一步分析发现，两个模块中基因显著性（GS）和模块成员（MM）存在显著相关性（图5d-e）
三、差异表达的免疫相关氧化应激基因的鉴定及功能富集分析
在以上两个模块中观察到基因间的交集，鉴定出27个差异表达的免疫相关氧化应激基因（DEIOSGs），GO分析显示，DEIOSGs主要参与了对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应等等；CC分析中DEIOSGs显著参与了神经元细胞体、内吞囊泡和分泌颗粒膜；MF分析显示DEIOSGs显著参与了抗氧化活性、血红素结合和四吡咯结合；KEGG主要富集于白细胞跨内皮迁移、动脉粥样硬化等途径（图6a-c)
四、鉴定Hub基因，并进行表达及功能分析
1、构建DEIOSGs的PPI网络并进行可视化分析，共获得六个Hub基因：NCF2、MMP9、ALOX5、NCF1、NCF4和CYBA。（图7a-b）
2、Hub基因在AS组中表现出更高的表达水平。ROC曲线表明，6个枢纽基因具有良好的诊断价值，MMP9在6个枢纽基因的AUC中最高。（图8a-b）
3、外部数据集验证发现，除CYBA外，所有其他基因的AUC区域均为>0.7。并且5个hub基因之间呈显著正相关。（图8c）
五、关键基因与免疫细胞的相关性分析
Spearman相关分析表明，ALOX5、NCF2、MMP9、NCF4、NCF1等5个基因与肥大细胞活化、巨噬细胞M0的浸润呈显著正相关，与NK细胞激活、单核细胞、肥大细胞静止、树突状细胞激活和B细胞幼稚细胞的浸润呈显著负相关（图9）
六、关键miRNAs、TF和药物-基因网络的GSEA分析和预测
1、GSEA分析表明，ALOX5、NCF2、MMP9、NCF4和NCF1高表达队列中的基因均在同种异体移植排斥反应和炎症中高度富集，表明这5个基因可能与炎症高度相关。（图10a-e）
2、图11a-b展示了靶向miRNA及TF分析，最后还进行了药物网络预测，显示了21种治疗AS患者的潜在药物。
七、利用单细胞分析鉴定免疫相关铁死亡基因并在体内外验证其表达
1、将上调和下调的DEGs与铁死亡、焦亡和坏死基因集进行交集，发现13个铁死亡相关的DEGs上调，10个坏死相关的DEGs上调，8个焦亡相关的DEGs上调。将上调铁死亡相关的DGEs与蓝色和绿松石模块中的基因之间的交集，鉴定了4个上调的免疫相关铁死亡基因： ALOX5、NCF2、AURKA和SLC2A6。（图12a-b）
2、ALOX5和NCF2在巨噬细胞M1、巨噬细胞M2和单核细胞中显著高表达。体外实验显示ALOX5和NCF1、NCF2、NCF4在AS组中高表达。（图13a-13c、图14a）
3、HE染色显示APOE-/-小鼠的主动脉瓣斑块形成面积更大。IHC结果显示，AS组的ALOX5和NCF2的阳性区域均高于对照组。Western Blot结果进一步证实，ALOX5和NCF2在AS组中的表达量高于对照组。（图14b-h）
研究总结：
免疫浸润和氧化应激在AS中起着重要作用。本研究进行了系统的生物信息学分析，以概述AS中的免疫浸润情况，并联合氧化应激来预测AS的诊断基因。此外，本文还探讨了铁死亡与浸润性免疫细胞之间的关系，并证实了ALOX5和NCF2对动脉粥样硬化具有良好的诊断价值。该研究为预测动脉粥样硬化斑块的进展提供了新的治疗靶点。
