大数据确定ccRCC的新型免疫表型亚型，有助于提高预后准确性

Prognostic Immunophenotyping Clusters of Clear Cell Renal Cell Carcinoma Defined by the Unique Tumor Immune Microenvironment

由独特的肿瘤免疫微环境定义的透明细胞肾细胞癌的预后免疫表型聚类

发表期刊：Front Cell Dev Biol

发表日期：2021 Dec 6：

doi:10.3389/fcell.2021.785410

一、背景

        肾细胞癌（RCC）是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，约占成年男性患者所有新病例的5%，占女性患者新病例的3%。RCC被分为三个主要的组织学亚型，包括透明细胞RCC（ccRCC）、乳头状RCC和嗜铬细胞RCC。ccRCC是RCC的主要亚型，占所有RCC患者的70%-85%，并且具有高度恶性。

TME中的细胞和分子处于动态变化过程中，反映了癌症的进化特性，这些因素共同促进了癌细胞的增殖、凋亡、转移和免疫逃逸。大量证据表明，不仅免疫疗法的疗效取决于肿瘤免疫微环境的激活，而且传统靶向治疗的疗效也取决于个体抗肿瘤免疫反应的强度。TME影响着包括ccRCC在内的癌症的发展、发生和治疗抵抗。因此，探索TME驱动肿瘤发生的潜在机制和发展，对于开发潜在的治疗预测模型，提高现有治疗策略的有效性，发现ccRCC治疗的新型精确靶点具有重要意义。

二、材料与方法

1.数据来源

（1）TCGA：531名ccRCC患者的RNA测序数据

（2）91名ccRCC患者来自国际癌症基因组联盟（ICGC）测试队列

（3）复旦大学上海癌症中心（FUSCC，中国上海）队列中共有64名接受ICTs单独治疗或与TKI联合治疗的ccRCC患者

（4）从复旦大学上海癌症中心队列中共招募了360名有长期随访资料的ccRCC患者作为免疫表型群的预后验证队列

（5）从The nCounter® PanCancer Immune Profiling panel中下载了770个基因，并在TCGA数据库中匹配了758个免疫基因

2.实验流程

(1)免疫表型的构建和亚群分析

(2)构建分类器以预测免疫表型簇

(3)免疫细胞浸润的评估

(4)单样本基因集富集分析

(5)DNA变异的评估：下载ccRCC患者的单核苷酸多肽（SNP）数据和MAF图谱，并使用R“maftools”包进行分析。从博德研究所下载了3级拷贝数变异（CNV）数据，并使用GenePattern云平台中的GISTIC2模块进行了分析

(6)免疫治疗疗效和长期预后意义的评估

(7)肿瘤免疫微环境表征的评估

三、实验结果

1.基于758个免疫基因的亚群筛选和初步构建

        首先，作者将nCounter® PanCancer Immune Profiling面板中的免疫基因与TCGA数据库中的转录组数据相匹配，得到758个免疫基因的表达谱。然后得到了相关矩阵，对ccRCC患者的相关矩阵进行了分层聚类，并确认了三个亚组（簇A、B和C）为最佳聚类（图2A,B）。从TCGA数据库中选取了531个ccRCC样本的传统临床病理指标，发现C群患者的免疫基因表达明显高于其他两个亚群，而A群的免疫基因表达处于中等水平（图2C）。

图2    基于758个免疫基因的筛选和亚群的初步构建

2.免疫簇与ccRCC肿瘤异质性的关系

        作者接下来在遗传和表观遗传水平上分析了免疫簇和肿瘤异质性的信息（图3A）。结果表明，VHL和PBRM1基因是ccRCC中最常发生突变的基因，簇A比簇B和C显示出相对较高的突变率。还对ccRCC进行了亚组分析，发现三个亚组中甲基化、miRNA和mRNA水平的异质性存在明显差异。接下来，根据TCGA数据库的RNA表达数据，测量了亚组间的骨髓浸润评分（StromalScore）、免疫评分（ImmuneScore）、肿瘤纯度（ESTIMATEScore）和干性指数评分（mRNAsi）（图3B-E）。总的来说，使用Kruskal-Wallis检验，三个免疫簇之间的肿瘤异质性存在明显差异。

图3    免疫集群预测ccRCC在训练和测试队列中的肿瘤异质性和结果

        分析了三个免疫亚群的预后，与簇A相比，发现簇B和簇C中的患者表现出相似的结果，生存率明显较差（图3F）。然后，将簇B和簇C合并为新定义的簇B和簇C，并比较簇A与簇B和簇C之间的预后，结果发现簇B和簇C与簇A相比，生存率明显较差（图3G）。为了验证免疫簇的预后价值，作者从ICGC队列中招募了91名有RNA-seq数据的ccRCC患者（图3H）。三个亚组之间的临床结果没有显示出明显的差异（图3I）。然而，与A组相比，B组和C组的预后明显较差（图3J）。

3.使用机器学习算法构建预测免疫亚群的分类器

        为了进一步探索亚群之间的差异，提高临床转化疗效，作者实施了一系列机器学习算法开发了一个简单的预测器，预测免疫亚群，从而将所有样本随机分配到预后差或好的组，直到获得最佳预测效率。共有28个中枢免疫基因被确定为亚组分类的预后预测器，命名为免疫分型簇（AUC =0.914；图4A）。作者总结了ccRCC中重要中枢免疫基因的预后意义。K-M生存分析强调了SOCS1、SAA1、TLR3、PRKCE、HNRNPA2B1、PDCD1、IL1R2、FCGR1A、CD36、CASP3、CARD11和BCL2作为ccRCC的癌症促进因素的预后意义。通过模型预测，91.9%的样本被分配到簇A，90.8%的样本被分配到簇B和簇C（图4B）。观察到ccRCC患者的免疫分型簇之间的生存率有显著差异（图4C）。进一步用Logistic回归系数计算每个样本的风险分数；簇B和C的风险分数明显高于簇A。（图4D）

图4    利用机器学习算法构建预测免疫亚群的分类器

4.免疫分型簇的临床病理学特征

        接下来，作者分析了不同免疫免疫分型簇中各种临床指标的差异。与簇A相比，发现簇B和C的肿瘤纯度明显下降，预后更差（补充图S2A）。簇B和簇C中CDKN2A的甲基化和mRNA表达水平明显高于簇A（补充图S2B,C），而两个簇之间的突变总数没有表现出明显差异（补充图S2D）。

补充图S2

        作者还分析了免疫分型簇之间的其他表型指标，如性别、年龄、肿瘤分期、吸烟状况、微卫星不稳定性（MSI）、切除或活检部位。发现吸烟组中来自B群和C群的ccRCC患者明显较多，而非吸烟组中来自B群和C群的患者较少。与簇A相比，无论吸烟状态如何，B组和C组的风险得分也明显升高。B组和C组中男性患者的数量明显较多（补充图S2）。MSI和年龄在两个亚群中没有显示出差异（补充图S2H，I）。如补充图S2J所示，与A组的患者相比，B组和C组的患者更多处于晚期。

5.免疫亚型的免疫细胞浸润、功能富集分析

        为了探索免疫细胞分布的差异，使用CIBERSORT算法分析TCGA数据库中ccRCC样本中22个浸润性免疫细胞的绝对比例。免疫亚型之间的免疫细胞浸润存在明显差异，尤其是浆细胞、CD4记忆性静息T细胞、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞（Tregs）、静息树突状细胞和静息肥大细胞（图5A，B）。与A组相比，B组和C组的CD8+T细胞明显增加。此外，用单变量Cox分析检查了淋巴细胞和髓系免疫细胞浸润的预后价值，如图5C所示。结果表明，淋巴细胞来源的CD4+记忆活化T细胞、Tfh细胞和Treg细胞升高与ccRCC患者的不良预后显著相关，而骨髓来源的静息肥大细胞的升高则与ccRCC患者的预后较好相关。

图5    免疫亚型的免疫细胞浸润和功能富集分析

        为了评估两个免疫亚型之间生物功能的差异，作者使用GSVA进行了基因组功能富集分析。采用Wilcox检验来确定两个免疫亚型中的差异表达基因（DEGs），筛选出了1045个DEGs，其中157个基因在簇A中上调，888个基因在簇B和C中上调。使用GSEA来探索簇B和C中上调的DEG的功能注释，这些DEG在C2功能中明显富集，如TP53靶点、REACTOME先天免疫系统和肿瘤发生标志，如雌激素反应晚期和KRAS信号下降（图5D，E）。此外，GSVA算法表明，簇A中的样本高度富集于免疫和代谢标志，如hedgehog 信号传导、胰腺β细胞和脂肪酸代谢。在簇B和C中，样本在增殖功能中高度富集，如有丝分裂细胞周期、缺氧和EMT过程（图5F）。接下来，使用广义线性模型Cox回归模型来测试每个功能对ccRCC患者预后风险的贡献（图5G）。这些结果表明，炎症反应信号对预后有积极影响，而有丝分裂细胞周期和IL6/JAK/STAT3信号是ccRCC患者的突出风险因素。基于这些结果，作者假设IL6 / JAK / STAT3信号传导或增殖表型可能是导致B类和C类预后不良的一个因素。

6.免疫亚型的DNA变异情况

        为了进一步探索两个亚群的DNA变异概况，作者分析了各组之间的单核苷酸多态性（SNPs）和CNVs的差异。发现两个亚组的拷贝数扩增和缺失有明显的差异（图6A）。簇A的扩增区域主要位于5q11.4、5q21.3和5q35.2，而删除区域主要位于1q42.3、2q37.1、3p14.3和6q27。B组和C组的扩增区主要位于3q26.33、5q21.3和5q35.3，这与A组相似；而删除区主要位于1p36.11、3p25.3、3q12.3、9q21.3和10q23.31，这与A组不同。接下来根据SNP、频繁突变或改变的基因和临床特征在免疫亚型之间进行聚类分析（图6D）。结果表明，簇B和C伴随着晚期临床指标和频繁的TTN、SETD2和BAP1基因突变。

图6    免疫亚型的临床病理特征

7.免疫亚型的免疫疗效分析

        为了进一步研究免疫亚型对ICTs的预测反应，作者比较了免疫检查点基因的表达，发现与簇A相比，簇B和C的PD-L1、PD-L2、LAG-3、IL-8、PDCD1、CTLA-4和TIGIT的表达明显升高，提示ccRCC的免疫浸润TME（图7A-G）。在这两个亚群中没有观察到PBRM1表达的差异（图7H）。然后从CA209-009队列中招募了35名接受ICTs的ccRCC患者，他们有特定的RNA-seq数据和临床反应数据。B组和C组的患者明显倾向于临床或中间获益（n = 22），而不是无临床获益组（n = 13）（图7I）。此外，在FUSCC队列中对64名单独接受ICTs或联合TKI的ccRCC患者进行分组后，发现来自群组B和C的ccRCC患者（13/32）具有CR/PR状态的患者比群组A的患者（6/32）显著增加（图7J）。

图7    免疫亚型的免疫疗效分析

        尽管在训练队列（TCGA，n =531）和测试队列（ICGA，n = 91）中，免疫表型簇明显定义了ccRCC患者的不良预后，但需要大规模的真实世界验证证据来确认其临床转化价值。因此，从FUSCC验证队列中确定了具有长期随访信息的360名ccRCC患者的免疫分型集群，并进行了生存分析。结果显示，与簇A相比，簇B和簇C能显著预测更差的OS。群组B和C的中位OS时间为66个月，而群组A为11个月（图8A）。此外，与群组A相比，群组B和群组C与不良的PFS明显相关。群组B和C的中位PFS为38个月，而群组A的PFS为104个月（图8B）。

图8    在一个真实世界的验证队列中，免疫亚型的预后影响和TME特征的描述

        为了给临床转化提供更多的实验证据，作者探索了免疫分型群中TME的特点。在FUSCC队列中对64个接受ICTs的ccRCC样本进行鉴定和分类后，在不同的集群中进行了H&E和免疫组织化学（IHC）染色分析（图8C）。发现B群和C群中含有TLS的病例（37.5%）明显多于A群（37.5%），这表明一个相对免疫富集的微环境，成熟的肿瘤浸润淋巴细胞，如CD8+T细胞的积累增加（图8D）。IHC分析显示，集群B和C中的恶性表型、活化糖化作用和PD-L1表达明显更具侵略性（图8E-G）。经过蛋白石多标签IHC染色，发现与免疫缺失群A相比，免疫缺失群B和C中3+CD4+CD8+TCRn免疫细胞浸润的患者，CD4+FoxP3+Treg细胞、CD8+T细胞和CD-预测对ICTs的有利反应丰度增加（图8H）。此外，B组和C组的PD-L1的表达水平也明显增加。总的来说，研究结果表明，促肿瘤发生的簇B和C可能与免疫富集的TME和ccRCC有关。

四、结论

        这项研究描述了提高ccRCC微环境中免疫背景的预后准确性的免疫分型集群。免疫热集群B和C显示了一个转录特征，表明促肿瘤性免疫浸润，结果明显比免疫冷集群A差。我们在ccRCC中发现了新的独立预后指标，突出了肿瘤表型和免疫环境之间的关系。