10X单细胞（单细胞转录组 & 单核转录组）空间联合分析解析独特
hello，大家好，今天我们继续分享单细胞空间联合分析的文章，大家如果看我的文章也应该发现了，空间转录组越来越多的用来解释关键细胞类型的生态位，非常重要，关于生态位的问题，我之前分享了一篇，文章在10X单细胞转录组、单细胞核转录组、VDJ、空间转录组联合分析识别人肺组织的免疫细胞生态位，解析的是空间层面肺组织免疫细胞的生态位，而今天我们要利用单细胞空间技术，解析肝脏组织的巨噬细胞的生态位，参考的文章在Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily-conserved hepatic macrophage niches ，非常棒的文章，我们今天就来分享。
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研究需要注意的热点
- 目标细胞的生态位
- 生态位保守的通讯信号
- 单细胞转录组和单核转录组对细胞类型的捕获存在差异
- 细胞区域通讯（生态位信号交流，也就是临近通讯）
Abstract
肝脏是身体中最大的实体器官，但它的特征仍然不完整。 在这里，研究展示了健康人和鼠肝脏的空间蛋白质基因组图谱，结合了单细胞 CITE-seq、单核测序、空间转录组学和空间蛋白质组学。 通过整合这些多组学数据集，提供了经过验证的策略来可靠地区分和定位所有肝细胞。 然后在七个物种中align这个图谱，揭示真正的
Kupffer cells and bile-duct macrophages的保守程序。 **还揭示了这些巨噬细胞各自的空间分辨细胞生态位和驱动它们独特转录组学特性的microenvironmental circuits。 分析证明胆管巨噬细胞是由局部脂质暴露诱导的，而Kupffer细胞主要依赖于它们通过进化保守的 ALK1-BMP9/10 轴与肝星状细胞的crosstalk 。
Introduction
单细胞转录组学的巨大技术进步使人们能够更好地了解跨物种不同器官的细胞组成。然而，仍然缺乏关于这些细胞如何在其独特的微环境生态位中组织的信息。此外，确定组织内单个细胞身份的特定细胞-细胞相互作用仍有待研究。虽然肝脏内肝细胞的空间组织已被了解，但非实质肝细胞的空间组织仍不清楚，这是小鼠肝脏的情况，但对于人类肝脏更是如此，其中大多数肝细胞的身份和精确定位是未知的。此外，转录组和蛋白质组之间的联系尚未得到研究，导致缺乏可靠的表面标记来通过流式细胞术和共聚焦显微镜识别、纯化或定位这些细胞。在这里，使用了包括 CITE-seq 和空间方法在内的蛋白质基因组学技术来识别小鼠和人类健康肝脏内的所有细胞及其特定位置。通过这样做，制定了识别和进一步研究不同细胞类型的策略。为了证明这种方法的有效性，利用这些信息，还确定了在健康肝脏中驱动不同肝巨噬细胞表型的保守空间相关信号。
Results
A practical proteogenomic atlas of the murine liver
为了生成肝脏的蛋白质基因组图谱，首先检查了检索所有肝细胞的最佳方法。 使用鼠肝脏，使用通过离体或体内酶消化分离的细胞与单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 比较了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)。 使用每种技术，我们都观察到了不同的细胞组成（看来单细胞转录组和单核转录组表征细胞丰度上还是有差异）。
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- 注： UMAPs showing annotations of cell-types and proportions of each cell type as a % of total cells in the UMAP isolated using (A) ex vivo digestion; 13144 cells, (B) in vivo digestion; 19428 cells and (C) nuclei; 8583 nuclei. (D) Average number of genes/cell in the annotated macrophage population following each isolation method.
虽然 snRNA-seq 产生的基因/细胞数量少于 scRNA-seq，但它最好地概括了体内观察到的细胞频率
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- 注： (E-J) Confocal microscopy images to determine true abundance of (E) fibroblasts and cholangiocytes (F) endothelial cells, (G) macrophages, (H) dendritic cells, (I) B cells and (J) T cells in vivo. Scale bar 200µm. (K) The percentage of each population was calculated based on the percentage of a given population divided by the total number of nuclei. A threshold was applied to the DAPI channel (picture 1) in ImageJ (picture 2) and nuclei were automatically counted based on the ImageJ ‘analyze particles’ plugin (size (micron^2 = 10-1000; circularity = 0-1; picture 3). Due to the density of some liver zones, some nuclei were not automatically counted (arrow, picture 3)。Those were then manually counted and added to the total number of nuclei. For the populations of interest, cells were counted manually based on specific markers (for example, CD3 for T cells, picture 4). Counting was performed blinded prior to analysis of the sequencing results. (L) Proportion of indicated cell types as a % of total cells identified in confocal microscopy images. Data are from 3-7 images per cell type taken from 2-4 mice.
鉴于每种方法的不同细胞组成，为确保所有细胞都可以进行分析，选择在我们的研究中使用所有protocol的组合。 为了在单细胞分辨率下研究 mRNA 和蛋白质表达，通过测序 (CITE-seq) 使用转录组和表观的细胞indexing。 因此，用 107-161 寡偶联抗体对选定的 scRNA-seq 样本进行染色。将数据汇集在一起进行单一分析，其中使用 TotalVI 将蛋白质和 mRNA 谱都考虑用于聚类。
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- 注：(A) Hepatic cells were isolated from healthy C57B/l6 mice by ex vivo (5 mice, 15 samples) or in vivo (5 mice, 19 samples) enzymatic digestion. Alternatively, livers were snap frozen and nuclei isolated by tissue homogenization (4 mice, 12 samples). Live cells/intact nuclei were purified using FACS. For cells, total live, live CD45+, live CD45-, live hepatocytes or myeloid cells (live CD45+,CD3-, CD19-, B220-, NK1.1-) were sorted. 18 cell preparations (7 ex vivo, 11 in vivo) were also stained with a panel of 107-161 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 185894 cells/nuclei were clustered using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data
对差异表达的基因和蛋白质的分析确定了 17 种细胞类型。 此外，确定了所有细胞的表面标志物，包括Kupffer细胞 (KCs) 的 VSIG4 和 FOLR2。
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- 注：(A,B) Top DEGs (A) and DEPs (B) for cell types identified in Fig. 1B. (C) Distinct profiles of cells or nuclei within the UMAP depending on isolation protocols; 71162 cells from ex vivo digestions, 96066 cells from in vivo digestions and 18666 nuclei. (D) Expression of VSIG4, CD206 and ESAM (protein, top) and Vsig4, Mrc1 and Esam (mRNA, bottom).
Distinct spatial orientation of hepatic myeloid cell subsets
为了定位鉴定出的细胞，使用 Visium 进行了空间转录组学分析。 为此，以两个不同的方向切割肝脏，以描绘肝脏组织和被膜
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- 注： Tissue and capsule images from Visium analysis with clusters overlaid.
沿着空间轨迹对每个 Visium 点进行排序，并根据已知的肝细胞分区标记对入口、门静脉周围、中部和中央区域进行注释
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- 注：(D) UMAP of zonation of Visium spots (left) & origin of the cells (right). (E) Zonation pattern
mapped onto tissue slice
通过使用参考 sc/snRNA-seq 数据，我们将每个点解卷积为其组成细胞类型，并研究细胞丰度如何随分区变化
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- 注： Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data
据报道，验证这种方法时，胆管细胞专门映射到门脉区，而 KCs 位于门脉周围和中间区。 此外，我们在所有区域都发现了 T 细胞、内皮细胞 (EC) 和基质细胞 (SC)，而在门静脉中发现了常规树突状细胞 (cDC)，在中央静脉中发现了少量存在。
为了以单细胞分辨率验证这些位置，接下来试图确定也可以通过共聚焦显微镜工作的最佳细胞特异性表面标记。 由于用于共聚焦显微镜的固定步骤通常会影响不同表位的完整性，因此无法预测哪些在单细胞悬液上起作用的抗体将在固定和完整组织上起作用。 因此，为了同时筛选多种抗体以识别通过显微镜起作用的抗体，进行了第二次 Visium 分析，并补充了 100 种寡偶联抗体（Visium 高度多重蛋白），这些抗体是根据 CITE-seq 结果选择的。
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- 注： mRNA zonation pattern in Visium Highly-Multiplexed Protein analysis and VSIG4-ADT expression pattern (left) and zonated expression patterns of indicated antibodies (right).
然后，使用 MACSimaTM 成像循环染色 (MICS) 技术和 60 重抗体panel，以单细胞分辨率验证在空间上起作用的抗体
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- 注：MICS analysis of indicated proteins and cell types. (J) Molecular Cartography of indicated genes and cell types
Unfortunately，无法为所有populations识别出有用的表面标记，例如，没有识别出足够的区分性表面标记，这些标记可以通过共聚焦显微镜在空间上区分 cDC 亚群。 因此，为了确认这些细胞亚群的位置，求助于允许 100 重空间 mRNA 分析的 Molecular CartographyTM (Resolve BioSciences)。 基于来自 sc/snRNA-seq 数据的 DEG 选择基因，这些数据也根据 Visium 进行了空间解析。 还使用胆管细胞基因（Epcam、Spp1）和已知的分区肝细胞基因（Glul、Cyp2e1、Hal、Sds）确定了该数据集中的portal-central轨迹
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- 注： (F) Top unbiased genes defining zonation trajectory from portal to central vein in Visium.(H) Molecular Cartography showing expression of indicated zonated hepatocyte mRNAs in liver tissue. Data are representative of 2 mice.
使用 Xcr1、Clec9a (cDC1s) 和 Cd209a、Mgl2 和 Clec10a (cDC2s) 的表达，我们证实 cDC1s 和 cDC2s 主要位于门静脉
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- 注：Molecular Cartography of indicated genes and cell types
由于 cDC2s 与单核细胞衍生的细胞共享许多基因，还检查了一般单核细胞/巨噬细胞（Cd14、Adgre1、Axl、Mafb、Cx3cr1、C5ar1）和 KC 特异性基因（Cd5l、Vsig4）的表达，to further validate their identification as bona fide cDC2s.。 该分析进一步表明，鉴定的 cDC2s 是真正的 cDC2s，缺乏任何巨噬细胞/单核细胞标志物，然而，它还鉴定了不同于 KCs 和 cDC2s 的门静脉和中央静脉巨噬细胞群。这些分析中 mRNA 表达的punctate nature与髓样细胞的树突形状相结合，使得很难令人信服地确定细胞边界并得出结论，这些 cDC2 和巨噬细胞是不同的细胞。 为了验证这一点，开发了一种将 mRNA 检测 (RNAScope) 与表面蛋白检测相结合的protocol。 结合蛋白质表面标记检查 cDC 或巨噬细胞特异性 mRNA 的表达证实了门静脉 cDC1、cDC2 和非 KC 巨噬细胞的存在
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- 注： mRNA (Xcr1, Flt3l, Mafb and Clec10a) and protein (MHCII and F4/80) expression in the same tissue slice. Scale bar 50µm. PV; portal vein, CV; central vein. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.
总之，通过结合多种空间转录组学和蛋白质组学方法，定位了小鼠肝脏内的所有细胞，并确定了骨髓细胞内的额外异质性，在单独检查 sc/sn-RNA-seq 数据集时没有发现。 这突出了结合单细胞和空间蛋白质组学技术来研究细胞异质性的力量。
Refined analysis of myeloid cells identifies three subsets of hepatic macrophages
为了更好地理解这些非 KC 巨噬细胞，我们在定义 11 个群体的 sc/snRNA-seq 分析中zoomed in骨髓细胞（cDC、KC、单核细胞和单核细胞衍生细胞）
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这包括 KC、3 组非 KC 巨噬细胞和细胞，其特征介于单核细胞和 patrolling monocytes 或巨噬细胞之间，称为过渡单核细胞。 对非 KC 巨噬细胞的仔细检查发现 cluster6 是腹膜巨噬细胞。 其余clusters之间的 DEG 表明 cluster7 可能类似于胶囊巨噬细胞，表达 Cd207 和 Cx3cr1，而 cluster8 类似于我们最近在脂肪肝中描述的 Gpnmb+Spp1+ 脂质相关巨噬细胞 (LAMs)。Conversion of the CITE-seq data into a flow cytometry file allowed an gating strategy to be defined.验证这一点，利用该策略来纯化cluster并评估基因表达。 在消化前清洗肝脏可以使清洗部分中的腹膜巨噬细胞富集，这表明这些是肝脏表面的污染物，而不是存在于肝脏组织本身中。 虽然 CITE-seq 标记不能区分cluster 7 和 8，但在panel中添加 CD207 使非 KC 能够分为 CD207+ 和 CD207- 巨噬细胞。 与它们被称为胶囊巨噬细胞的名称相吻合，如果解剖和消化胶囊，CD207+ 巨噬细胞的相对丰度就会增加。 然而，尽管分子图谱证实了胶囊中存在 Cd207+ 巨噬细胞，但它也揭示了中央静脉的 Cd207+ 巨噬细胞，而门静脉很少发现这种巨噬细胞.
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- 注： (E) Expression of VSIG4 and F4/80 (left) or MHCII, CD11c and DAPI (right) by confocal microscopy. Capsule macrophages (left) or MHCII+ capsule macrophages (right) identified by white arrows. Scale bar 50µm. (F) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at liver capsule. (G) Expression of VSIG4, F4/80, GLUL and DAPI (left) or F4/80 or CCR2 (right, inset) by confocal microscopy. Scale bar 100µm. (H) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at portal triad. PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.
因此，cluster7 由囊和中央静脉 CD207+ 巨噬细胞组成。 这一发现进一步证明需要空间方法来确认细胞身份，因为这种特征以前被认为是胶囊巨噬细胞群所独有的。 分子图谱还在门静脉和中央静脉处鉴定出巨噬细胞，表达 Ccr2 和 Chil3，类似于过渡单核细胞（cluster11）。 最后，发现一群表达 Gpnmb 的巨噬细胞专门位于胆管周围。 由于 Gpnmb 表达是 cluster8 特异性的，并且这些细胞类似于 LAM，我们将这些细胞称为胆管 LAM。
Macrophage subsets reside in distinct spatial niches
由于所有巨噬细胞群都与其局部环境中的 CD45- 细胞密切接触，进一步分析了 CD45- 细胞，确定了 EC 和 SC 的多个亚群以及区分它们的gating strategy。EC 可以进一步细分为 4 个不同的cluster，对其位置的分析使它们能够被识别为中央静脉 EC（cluster 10）、LSEC（cluster 9）、门静脉 EC（cluster 11）和淋巴 EC（LEC；cluster 12）。由于 Visium 在门静脉和中央静脉中都发现了成纤维细胞，并且正如之前的一份报告表明这些细胞中存在不同的亚群，我们进一步分析 SCs 以更好地评估它们的异质性。 这揭示了仅限于胶囊的间皮细胞和成纤维细胞的亚群。 Myh11+ 血管平滑肌细胞 (VSMCs) 位于肝动脉、门静脉和中央静脉周围，发现 Mfap4+Svep1+Clic5-Reln-成纤维细胞是中央静脉成纤维细胞。 最后，确定了位于胆管细胞周围的 Clic5+Reln+ 成纤维细胞 (cluster3) 的一个subset，将其称为胆管成纤维细胞。 总之，这些空间上不同的 ECs 和 SCs 子集的存在突出了不同巨噬细胞种群所在的特定微环境的独特性。
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- 注：Hepatic macrophage populations reside in distinct niches。(A) UMAP of murine CD45- cells (83410 cells/nuclei) isolated from Fig. 1B and re-clustered with TotalVI. (B,C) Top DEGs (B) and DEPs (C) between cell types identified. (D) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data. (E) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at central vein (left) and 2 different portal triads (center and right). (F) UMAP of murine stromal cells (5430 cells/nuclei) isolated from the UMAP in Fig. 3A and reclustered with scVI. (G) Top DEGs between different cell types identified. (H) Identification of Mesothelial cell (top) and VSMC (bottom) signatures on zonated Visium data. (I) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at the liver capsule. (J) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at the central vein (left) and portal triad (right). PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.
A practical proteogenomic atlas of the healthy human liver
为了确定巨噬细胞亚群之间的保守程度及其在小鼠和人类肝脏之间的不同微环境生态位，我们接下来使用 sc/snRNA-seq 和 CITE-seq 对 19 次肝脏活检生成了人类肝脏的蛋白质基因组图谱。其中，大多数在组织学上是健康的，只有 5 名患者表现出>10% 的肝脂肪变性。细胞比例因所使用的隔离技术而异，虽然患者之间存在一些差异，但这与手术无关。由于 Visium 可靠地定位了鼠肝细胞，我们使用它来定位 4 次活组织检查中的人类肝脏细胞。由于>10% 脂肪变性的患者与健康样本（<10% 脂肪变性）分开聚集，使用健康样本来计算基线分区，然后将此轨迹转移到脂肪变性样本上。这确定了这些患者的脂肪变性主要位于中心周围。这与之前的临床研究相吻合，即中央周围脂肪变性在 NAFLD 患者中最常见，尤其是在门静脉周围区域通常不受累的早期疾病中。值得注意的是，尽管中性粒细胞优先位于脂肪变性区，但整体细胞分布不受中央周围脂肪变性的影响
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- 注：Identification of bona fide Kupffer cells across species 。(A) Cells or nuclei were isolated from liver biopsies (~1-2mm3; 14 cells, 5 nuclei) from patients undergoing either liver resection, cholecystectomy or gastric bypass. Live cells/intact nuclei were purified using FACS. Either total live, live CD45+, live CD45- or lineagecells (live CD45+,CD3-,CD19-) were sorted. 7 cell samples were stained with a panel of 198 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 167598 cells/nuclei were analyzed using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data. (C) UMAP of Visium data from 4 patient biopsy samples. (D) Split of Visium spots based on %steatosis. (E) Healthy and steatotic Visium liver tissue with clusters overlaid and H+E staining to identify steatotic zones. (F) Zonation of Visium data (top) with zonation pattern mapped onto liver tissue (bottom). (G) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto Visium zonation trajectory, healthy (top), steatotic (bottom).、
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An evolutionarily-conserved program of KCs
迄今为止，还没有描述真正的人类 KCs 的经过验证的标记。在解释准确定义人类 KCs 的困难时，发现单核细胞和巨噬细胞在人类 sc/snRNA-seq 数据中形成了一个单一的连续体，阻止了人类 KCs 的简单定义。为了进一步研究潜在的人类肝脏巨噬细胞异质性，我们分析了骨髓细胞，确定了 10 个cluster。为了定义 KC，接下来检查了这些cluster对前 25 个鼠类 KC 基因的表达，这些cluster确定了 cluster10 是真正的人类 KC。与小鼠不同，它们优先位于中间区域。 Cluster9 也表达了许多这些基因，但缺乏 TIMD4，这表明这些细胞可能是最近招募的单核细胞衍生的 KCs (moKCs)。尽管单独的 VSIG4 表达不能准确识别人类肝脏中的 KC，但发现 VSIG4 蛋白是 CITE-seq 数据中人类 KC 的最佳标记物，突出了检查表面蛋白质组和转录组的重要性。这通过流式细胞术和对人肝脏的 VSIG4 和 KC 特异性基因 CD5L 的共染色进行了验证，这也证实了它们的中带定位。为了评估 KC 身份在进化中是否进一步保守，对猕猴、猪、仓鼠、鸡和斑马鱼的肝脏进行了分析。我们通过将保守的人-鼠 KC 签名映射到数据集上，以无偏见的方式识别了 KC。然后检查了确定的每个 KC 群体的主要特征。观察到跨物种转录组的强烈重叠可能是由于核心 KC 转录因子的保守表达。 VSIG4 蛋白表达在猪和猕猴 KCs 中也是保守的。同样，还能够根据保守基因识别跨物种的大多数其他肝细胞。 cDC2s 是主要的例外，因为特定的 cDC2 标记基因并非在所有物种中都是保守的。
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LAM location is altered in the steatotic human liver
除了 KCs，还在肝囊中发现了人类 CD68+VSIG4-巨噬细胞，靠近中央静脉和门静脉以及胆管。在健康猕猴肝脏的门静脉和中央静脉以及胆管中也观察到了类似的populations 。检查 scRNA-seq 数据并与小鼠特征进行比较，确定了未成熟和成熟的 LAM，从而能够定义保守的 LAM 特征。尽管最近的一项研究表明这些细胞对纤维化肝脏具有特异性，但在所有使用 scRNA-seq 分析的患者中都发现了 LAM，但在 2 个脂肪变性 >10% 的肝脏中，LAM 的比例有增加的趋势。与显微镜和鼠胆管 LAM 一致，人类 LAM 位于非脂肪肝的汇管区。然而，在脂肪变性的人类肝脏中，LAM 主要位于中央周围，与脂肪变性相关。在喂食western diet (WD) 36 周以诱发脂肪肝疾病后，在小鼠中使用 Visium 也验证了 LAM 位置的这种变化。在这里，与整个肝脏存在脂肪变性相吻合，在门静脉、门静脉周围和中间区域发现了 LAM。鉴于两个物种中 LAMs 的位置与过量脂质的存在以及发现 LAMs 的不同位置之间的生态位细胞的异质性相关，这表明 LAM 表型和丰度可能受脂质暴露而不是特定的在两个位置保守的局部细胞 - 细胞相互作用。
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Differential NicheNet analysis across species reveals a crucial role for the ALK1-BMP9/10 axis in KCs.
为了评估保守的细胞 - 细胞相互作用与局部代谢物（如脂质）在推动跨物种巨噬细胞异质性方面的作用，我们在不同的肝巨噬细胞和存在于各自nichs中的 CD45-细胞之间进行了差异 NicheNet 分析，重点是配体和在人和小鼠中都保守的受体。与 KCs 相比，这揭示了 LAMs 的特定配体 - 受体对很少，进一步暗示驱动 LAM 表型的主要信号可能不是来自独特的细胞 - 细胞相互作用。与此一致，用乙酰化低密度脂蛋白培养的 BM 单核细胞表达 LAM 相关基因，表明脂质在诱导 LAM 表型中起主导作用。对形成 KC 生态位蓝图的细胞串扰的进一步研究发现，人和小鼠之间存在多个保守的配体-受体对。其中一个，KCs（ALK1；由 Acvrl1 编码）和星状细胞（分别由 Gdf2/Bmp10 编码的 BMP9/10）之间的 ALK1-BMP9/10 回路被发现在所有 7 个物种中都是保守的，并被预测控制表达许多保守的 KC 转录因子。为了验证这个轴，我们生成了 Fcgr1-Cre x Acvrl1fl/fl 小鼠，从巨噬细胞中消除了 ALK1。这导致 VSIG4+ KCs 几乎完全丧失，表明进化上保守的 ALK1-BMP9/10 轴对于肝脏中 KC 的存在至关重要。
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Discussion
为了生成任何人体组织的实用细胞图谱并解开对居住在该组织中的细胞的身份至关重要的细胞-细胞回路，需要四个关键信息：（i）存在的所有细胞的清单，（ii）位置 组织内不同细胞之间的相互作用，以识别相邻细胞之间的相互作用，(iii) 人类和动物模型之间的alignment，允许任何预测的细胞 - 细胞相互作用受到干扰，以及 (iv) 识别可靠的基于抗体的panel有效筛选不同患者和/或转基因动物。 在这里，通过整合单细胞和空间转录组学和蛋白质组学数据，为肝脏提供了这 4 条信息，并揭示了控制肝脏巨噬细胞发育的进化上保守的microenvironmental circuits。
强调需要结合不同的分离策略来正确分析所有肝细胞，证明如果没有 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的组合，肝脏图谱中将缺乏不同的人和鼠基质细胞亚群。解开所有肝细胞的空间定位，确定了健康小鼠、人类和猕猴肝脏胆管周围的 LAM。然而，当存在脂肪变性时，LAMs 会扩张并定位到脂肪变性的周围区域，这让人想起 LAMs 在肥胖小鼠肝脏中的扩张。这种空间信息至少部分否定了 LAM 身份是由纤维化基质细胞特异性诱导的假设，并支持 LAM 主要由局部脂质暴露诱导的概念，正如在实验中所证明的那样。尽管脂质的确切来源仍有待确定。还提供了七个物种的肝脏图谱的对齐方式。这揭示了稳态 KCs 的保守转录组程序，并揭示了 KCs 与构成其生态位的细胞之间的空间限制和保守的配体-受体对。强调在试图了解疾病如何扰乱细胞之前首先表征健康组织的必要性，我们将 DLL-NOTCH 相互作用确定为稳态 LSEC 和 KC 之间进化保守的串扰，因此并非肝细胞癌或纤维化所独有，正如最近提出的那样。同样，发现 FOLR2 表达不是肿瘤相关肝巨噬细胞所特有的，而是在健康小鼠和人类肝脏的 KCs 上表达（mRNA 和蛋白质）。最后，应用蛋白质基因组学管道，从广泛的寡偶联抗体面板开始，用于单细胞和空间分析。这是至关重要的，因为转录组分析并不总是与通过流式细胞术或显微镜检测蛋白质的能力相对应。通过广泛筛选，确定了分离和定位肝巨噬细胞及其各自生态位细胞的最佳表面标志物。这既可以验证单细胞水平的空间位置，也可以有效筛选转基因小鼠模型的 KCs 损失。使用定义的panel对 Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl 小鼠的表征很容易证明 ALK1-BMP9/10 轴在 KCs 中的重要性，强调巨噬细胞-成纤维细胞的串扰比生长因子的交换更进一步。展望未来，将这些相对便宜的抗体组应用于大型患者队列或多个转基因小鼠模型应该能够有效识别任何扰乱肝脏稳态的扰动。
Methods(关注一些关键的方法)
Probabilistic graphical modelling （Modelling of Visium data ）
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Reference for deconvolution
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Deconvolution
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Differential abundance along zonation
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生活很好，有你更好
