掌握这些三叶青种植技术，农田收益翻倍增加
一、三叶青地下块根繁殖技术
三叶青繁殖一般选择地上部分扦插繁殖,但是由于三叶青母本极少、多代无性繁殖后,易出现品质退化现象。三叶青地下块根具有稳定的三叶青特性,利用野生或人工培育的三叶青地下药用块根进行繁殖,培养更多的母本资源,是保证品质的重要繁殖方式。
1.解除休眠
三叶青地下块根也具有一定的休眠性,在进行三叶青地下块根繁殖前,首先解除三叶青地下块根的休眠特性。一般最好是在大泡沫箱底覆盖1~2cm的湿河沙,将采集到的新鲜三叶青地下块根放在装有河沙的泡沫盒内,再覆盖3~5cm的河沙,然后再放一层三叶青地下药用块根,再覆盖河沙,一直到距离泡沫箱顶3~5cm时,用河沙将三叶青完全覆盖。如果平均温度低于10℃,泡沫箱可以直接放在室内阴凉、避光的黑暗处放置40~50d;如果自然平均温度高于10℃,必须将泡沫盒放置于冷库内,冷库的温度设置在5~10℃。
2.催芽
经过低温冷藏的三叶青,当外界温度达到15℃以上时,将三叶青从河沙中取出移栽到装有基质的穴盘中,然后将穴盘放置在温度控制在20-25℃温室内,保持10~15d,穴盘上用湿的纱布覆盖,每天揭开纱布,视基质表面的湿度,当基质发白,立即用喷雾器喷水,用喷雾器给基质喷水1次,等三叶青块根长出的芽长度有2~3cm,立即去掉纱布。
3.移栽基质配制
三叶青地下块根育苗培养最好配制专业的营养基质,目前一般采用三叶青育苗基质按体积比的配方,腐殖60%~65%;泥炭35%~30%;长效缓释肥2%~3%;草木灰3%~2%。
4.种苗大田移栽
经过催芽的三叶青地下块根,等新芽长出后,即可进行移栽,经过15~20d催芽处理,三叶青就会长出2~3cm的芽,当有80%的三叶青长出2~3cm的芽时,立即去掉穴盘上的纱布,当催芽的三叶青85%的植株叶片有3张叶片生长开后,即可带基质移栽到大田。自然界平均气温在25℃以下,可以将穴盘直接放在温室大棚内,穴盘上用湿的纱布覆盖,密闭温室大棚,适当加温,将大棚温度提升到20~25℃,每天揭开纱布,视基质表面的湿度情况进行补水,当基质发白,立即用喷雾器喷水;当自然界平均气温在25℃以上,必须用遮阴率70%的遮阳网覆盖温室大棚进行遮阴处理,采用地下块根繁育的种苗,品质比较纯正,可以作为建立母本园的最佳方式,为后期大面积繁育种苗提供充足的采穗母本。
二、三叶青组培快繁技术
当今植物组织培养技术已经发展得相当成熟,被广泛应用于各种濒危植物药用植物、经济作物的离体再生和快速增殖。为了保护三叶青野生资源,提高其种苗的均一化水平和人工驯化栽培的科技含量,实现三叶青产业化发展,开展三叶青组培快繁和利用组织培养生产次生代谢物等研究也是解决供需矛盾的可行途径之一。
1.试管苗诱导
目前,主要采用茎尖、腋芽、带芽茎段外植体诱导丛生芽以获得三叶青试管苗(图3-1)。
(1)外植体处理及培养条件选取幼嫩茎段,剪取成带1~2个腋芽的1.5-~2cm茎段,洗洁精清洗2min,流水冲洗1~2h,无菌水冲洗3遍。移至无菌超净台,先用70%乙醇洗30s,再用0.1%的升汞灭菌8~10min,期间轻轻振荡,最后用无菌水冲洗4-5次,每次5min。由此获得无菌材料。用日光灯提供光照,强度为20~30μmo/(m2),光照时间16h/d,培养室温度控制在(28±2)℃。三叶青试管组培苗的最适生长温度为30~35℃,SOD酶可溶性蛋白含量均最高,含量最高,而MDA含量最低,有利于幼苗地上部生长当温度降至10℃以下或升至40℃以上时,则需考虑做好保温或降温措施。
(2)诱导培养及增殖培养将处理好的外植体接种到12MS+BA(0.52mg/L)+NAA(0.05~0.5mg/L)的培养基上,进行诱导培养15~30d。最佳增殖培养基为MS+6-BA(0.5~1mg/L)+mT(0.5mg/L)+IBA(lmg/L)。在6-BA浓度≤1.0mg/L时,增殖倍数随着6-BA浓度的升高而升高,植株较髙,但当6-BA浓度≥1.0mg/时,密集的丛生芽开始增多,少许出现愈伤组织,植株较矮。增殖倍数随NAA浓度的增大而减小,株高随NAA浓度的増大而増大3。因此可根据自己的需要适当调整浓度。
(3)生根培养当芽长到2cm左右时,转入生根培养阶段,生根培养采用1/2MS+2,4-D(0.5mg/L)+IBA(0.5~1mgL),培养15~25d。10d可见大多数无根小苗的基部出现乳白色根突起,均为棕色、细长、密布白色根毛的大量侧根。多人的试验发现IBA是最有利于三叶青生根的外源性生长素,且愈伤及芽苗的褐化最轻,而其他生长素更有利于愈伤组织的生长而限制器官的分化,对IBA浓度的测试显示浓度过低,在切口处会产生大量的愈伤组织,阻碍了芽的生长和分化,不利于增殖培养;IBA浓度适当提高能促进芽的生长,但浓度大于lmg/L时,芽的增殖系数明显下降。平均根数随着IBA浓度升高而升高,当IBA浓度达1mg/L后,趋于平缓,低浓度时(≤0.5mg/L)的平均根长略大于高浓度时的平均根长。0.5~1mg/LIA浓度能使根早生快发,根粗而多,根系发达,主根粗壮,侧根发达,且芽苗生长健壮,叶色浓绿,生长整齐一致。
(4)驯化移栽当试管苗长出3~4条根时即可出瓶,出瓶前先置于温室大棚中炼苗2~3d,再打开瓶盖在培养基表面洒一层水,炼苗3~5d,然后取出组培苗,仔细将粘附在根部的培养基用清水洗净,移栽至高压灭菌锅灭菌后的蛭石:草炭土比例2:1混合的塑料苗盆中驯化3~5d。将驯化之后生长良好的苗取出,轻轻洗去根上的培养基,剪去靠下端的叶片,仅留取顶端叶片即可,移至育种盘中并保湿,置于人工气候室培养。10d后揭去塑料盖。在外植体污染控制阶段,培养基中加入0.3gL真菌抗菌剂和1mg/L氨苄西林钠可有效抑制三叶青茎段外植体的污染。置于温度20~25℃、相对湿度75%~85%的大棚中生长2~3月,大棚保持适度通风,遮阴50%~70%,并适时浇水,组培苗成活率可达85%以上,之后即可移栽到大田进行正常田间管理。史清英对三叶青茎段外植体组织培养体系进行了优化,并发现在其组培苗根部定殖印度梨形孢,可明显促进组培苗的生长发育,其株高和干鲜重都显著高于未接种的三叶青幼苗。杜苏瑞6利用发根农杆菌K599侵染三叶青实生苗或组培苗的叶片,成功诱导出转基因毛状根,为利用三叶青毛状根作为生物反应器大规模生产三叶青次生代谢物提供了理论依据和技术支撑。
2.愈伤组织或悬浮细胞培养生产次级代谢产物
黄酮类化合物是三叶青的重要药用成分。但由于三叶青生长速度慢,形成块根周期长,远远满足不了需求。因此利用植物组织培养技术进行三叶青次级代谢产物的生产是解决目前供需矛盾的有效途径之一(图3-2)。
(1)愈伤组织培养生产黄酮编者研究团队在三叶青愈伤组织培养及次代谢调控方面研究确定了促进愈伤组织生长、最利于黄酮积累的最佳培养基加配方和培养条件。取生长良好的三叶青植株的幼嫩叶片,自来水冲洗21,8%次氯酸钠消毒5m,再用0.1%HC溶液消毒5mi,然后用无菌水冲洗8次,无菌滤纸吸干水分,切成1.5~2cm2的小块,先在促进愈伤组织生长的最佳处理组合条件:12h/d光照、Ms+6-BA(3.0mg/L)+NAA(2.0mgL)+蛋白陈(2g/L)下培养30d,再转入最利于黄酮积累的处理组合:连续光照、B5+6BA(4.0mgL)+NAA(2.0mg1)+苯丙氨酸(40mg/L)下培养20d。其中,三叶青叶片愈伤组织的最适培养温度为28℃,光照能诱导三叶青愈伤组织中黄酮类化合物的形成和积累,24h/d光照为其适宜光周期。
(2)悬浮细胞培养生产黄酮编者研究团队在三叶青悬浮细胞培养8及次级代谢调控11面研究确定了促进悬浮细胞生长、最利于黄酮积累的最佳培养基配方和培养条件。比较了两种三叶青细胞悬浮体系中细胞增殖和总黄酮积累的动态,构建了增殖系数大,继代后性能稳定,总黄酮含量高于原植株的三叶青悬浮细胞系89。三叶青颗粒状愈伤组织悬浮培养生产黄酮,先在MS培养基(含3%蔗糖、30 mmOl/L总氮浓度、NH4-NO3为1:2、6-BA4mgL、IBA1.5mg/L)上培养24d,再更换到B5培养基(含5%蔗糖、30mmoL总氮浓度、NH4-NO3为0:1、6-BA2mg/L、吲哚丁酸1.5mg/L)中培养l6d收获黄酮。采用悬浮培养方式生产三叶青颗粒状愈伤组织不仅可以大大地缩短生产周期,而且细胞培养物中的总黄酮量也明显高于原植株及固体培养的愈伤组织,具有较大的可行性。
编者研究团队还研究了稀土元素对三叶青悬浮细胞代谢相关酶活性及同工酶表达的影响,结果显示100m0/LCe3和Nd最有利于其生物量及黄酮的积累,50~200mo/L稀土离子对CAT、POD、PAL、EST等酶表达情况有显著影响;稀土离子诱导生物量及黄酮积累的机理与其激发初生及次生代谢途径中关键酶的合成,诱发胁迫防御反应,提高细胞代谢水平有关。通过对稀土离子的诱导效应和Ca2信号通路的关系进行研究显示,在培养基中加入金属诱导子与降低钙离孑浓度或增加钙离子阻断剂相结合的方式,能促进三叶青悬浮细胞增殖及提高其黄酮产量1。通过对继代多次的三叶青愈伤组织的遗传稳定性进行了考察,研究表明继代4次以内的愈伤组织遗传稳定,但继代次数增加,增加了DNA点突变和种性退化的几率,提出为避免保存的原始种质基因丢失,尽可能采用试管苗方式继代保存的建议。
(3)种质资源及试管苗保存现有的常规植物离体快繁及保存技术需要繁继代、工作量大、成本高,易导致材料的污染、混淆,且随着继代次数的增加,遗传变异率提高,从而使保存的原始种质基因丢失,出现代谢物含量变化植株再生能力下降等现象,严重影响试管苗的质量和利用价值。
编者研究团队建立了一种稳定高效的三叶青种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法,。已获中国发明专利授权ZL201310218348.3。通过适宜的培养条件和合理的抑制剂、破眠剂使用,建立三叶青试管苗的限制生长保存以及保存后复苏培养技术体系(图3-3至图3-6),使其试管苗保存10个月期间不需继代,植株生长正常,存活率为100%,大大延长继代培养时间,且保存材料的后代经DNA和蛋白质分子标记技术检测均未发生遗传变异。因此该方法可防止常规的传代保存法由于多次传代后造成的种性退化及病毒感染,保证种质的优良性和纯洁性。
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